Оценка сцепления гена PLARG, контролирующего устойчивость к ложной мучнистой росе у подсолнечника, и микросателлитных локусов ДНК

Введение. Одна из наиболее вредоносных болезней подсолнечника – ложная мучнистая роса, вызываемая оомицетом Plasmopara halstedii (Farl.) Berl. et de Toni . Потери урожая в благоприятные для развития болезни годы достигают 90 % [1; 2]. Для борьбы с этой болезнью применяют различные приемы. Это агротехнические методы, такие как севооборот, оптимальная густота посева, фитосани-тарные прополки, удаление пораженных корзинок, уборка послеуборочных остатков, зяблевая вспашка [3]. Однако агротехнические приемы являются больше вспомогательной мерой, не давая 100 % гарантии защиты.

Применяют также химические методы защиты от болезни: это обработка семян перед посевом препаратами на основе мефеноксама и опрыскивание в период вегетации фунгицидами группы триазолов и стробилуринов. В последнее время сообщается о том, что оомицет приобрел устойчивость к фунгицидам. Это ограничивает эффективность химических веществ и поднимает вопрос об экономи- ческой целесообразности их использования [4; 5; 6].

Наиболее экологичная стратегия предотвращения потерь урожая подсолнечника, вызванных патогеном, заключается в поиске новых генов устойчивости и введении их в селекционный материал.

Существуют две категории устойчивости подсолнечника к P . hal stedii . Это качественная устойчивость, вызванная основными генами Pl, и количественная, которая контролируется несколькими генами ( QTL) [7]. На сегодняшний день у подсолнечника идентифицировано 36 основных генов Pl, расположенных в пяти группах сцепления ( LG 1, 2, 4, 8 и 13) [8 ; 9; 10] и трех QTL , расположенных в LG7, LG 10 и LG8 [7; 11]. Один или несколько основных генов Pl 1 , Pl 2 , Pl 5 , Pl 6 , Pl 7 и Pl 8 обеспечивали устойчивость ко всем расам P. halstedii и до начала 2000 - х годов широко использовались в селекции на устойчивость. К сожалению, из - за возникновения новых рас устойчивость многих из этих генов была преодолена в полевых условиях [6].

Перспективным является введение в селекционный материал гена P l arg , контролирующего устойчивость ко всем известным на сегодняшний день расам. В литературных источниках сообщается , что ген Pl arg был интрогрессирован в культурный подсолнечник из дикорастущего вида H. argophyllus в 1989 г . американским исследователем Seifer G.J. [13]. Он путем скрещивания линии культурного подсолнечника HA 89 и H. argophyilus получил линию ARG-1575- 2, несущую ген P l arg . Затем были получены четыре инбредные линии RHA 419, RHA 420, RHA 443 и RHA 464, несущие этот ген и используемые во многих селекционных программах в течение двух десятилетий. При этом RHA 419 и RHA 420 были получены непосредственно из линии ARG -1575-2, тогда как линии RHA 443 и RHA 464 – из линии RHA 419 [14 ; 15].

Ген Pl arg был картирован в группе сцепления LG 1. Классический генетический анализ, основанный на фенотипировании сегрегирующих популяций, показал, что он не сцеплен с другими генами Pl 14 , Pl 13 и Pl 16 , находящимися в этой же группе сцепления [18]. Pl arg является основным локусом Pl, по - прежнему эффективен против всех известных рас P. halstedii и способен контролировать ложную мучнистую росу в течение длительного периода времени [16 ; 17]. Введение этого гена в селекционный материал позволит создать линии и гибриды подсолнечника с комплексной устойчивостью к расам патогена. Для значительного сокращения времени и затрат на их создание необходимо использовать методы ранней и точной диагностики носителей гена Pl arg в гибридной популяции, а именно молекулярное маркирование данного гена.

В литературе опубликован ряд молекулярных маркеров, сцепленных с локусом Pl arg [19; 20; 21]. При разработке молекулярного маркера, как правило, используется ограниченное число генотипов, а степень сцепления с маркируемым геном определяется на основе анализа одной - двух расщепляющихся популяций. Поэтому всегда необходима валидация молекулярных маркеров на широком наборе генотипов перед практическим использованием маркера в селекции.

Цель данной работы - исследовать микросателлитные молекулярные маркеры из литературных источников, сцепленные с геном Pl arg , для подтверждения их связи с геном в генотипах селекции ВНИИМК и определить их диагностическую ценность для практического использования в селекции на устойчивость к возбудителю ложной мучнистой росы.

Материалы и методы. Валидацию молекулярных маркеров ORS 662, ORS 509 и ORS 822 проводили на гибридных комбинациях линий подсолнечника RHA 419 х ВК 776 и RHA 419 х ВК 925.

Скрещивания проводили в условиях теплицы по следующей схеме: ♀ RHA 419 16

х ^ ВК 776 и $ RHA 419 х ^ ВК 925. Корзинку накрывали изолятором из нетканого материала. В течение последующих 4-5 дней кастрировали цветки в фазе выхода тычиночных нитей из венчика в пределах каждого вновь зацветающего пояса. Отцовские растения также изолировали перед цветением. Пыльцу для опыления собирали и наносили на рыльца пестиков материнских растений [22]. Гибриды F 1 выращивали в поле. Затем было проведено самоопыление растений F 1 и получено потомство F 2 . Растения поколения F 2 тестировали в лабораторных условиях методом искусственного заражения на устойчивость и восприимчивость к ложной мучнистой росе [23].

Для выделения ДНК использовали фрагменты зеленых листьев подсолнечника. Экстракцию ДНК проводили с использованием набора для выделения DiamondDNA Plant kit (Россия). Концентрацию ДНК в полученных препаратах определяли визуально по интенсивности свечения пробы объемом 10 мкл в ультрафиолетовом свете в 1% - ном агарозном геле с добавлением 2 мкл бромистого этидия. Для ПЦР - анализа применили по три пары праймеров, разработанных для маркирования локуса    Pl arg : ORS 662   (F:

CGGGTTGGATATGGAGTCAA, R: CCTTTACAAACGAAGCACAATTC), ORS 509 (F: CAACGAAAAGACAGAATCGAAA, R: CCGGGAATTTTACAAGGTGA) и ORS 822 (F: CAATGCCATC TGTCATCAGCTAC, R: AAACAAACCTTTGGACGA AACTC) [24].

Полимеразную цепную реакцию выполняли в реакционной смеси объемом 25 мкл следующего состава: 67 mM трис - HCl, рН 8,8; 16,6 mM сульфата аммония; 1,5

3,0 mM MgCl2; 0,01 % Tween 20; 200 μM dNTP; по 0,5 μM каждого праймера; 10 нг геномной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК полимеразы (НПО «Сибэнзим», РФ). Амплификацию ДНК проводили в термоциклере MiniAmp Plus (Thermo Fisher Scientific, США). Темпера- турно-временные режимы амплификации описаны ранее [25].

Электрофорез продуктов амплификации проводили в 2% - ном агарозном и 8%- ном полиакриламидном гелях. Использовали камеры SE- 20 и VE - 20 для горизонтального и вертикального электрофореза соответственно (Хеликон, Россия). Результаты электрофореза документировали при помощи гель - документирующей видеосистемы BIO PRINT (Vilber Lourmat, Франция). Размер фрагментов ДНК определяли с использованием программного обеспечения BioCapture (Vilber Lourmat, Франция) относительно маркера длины фрагментов ДНК GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific (Сибэнзим, Россия).

Математическую обработку результатов расщепления проводили с использованием χ 2 - критерия соответствия фактических расщеплений, теоретически ожидаемым в моно - и дигибридных скрещиваниях. Расчет частоты рекомбинации r и ошибку рекомбинации s p по результатам расщепления в F 2 рассчитывали по методу максимального правдоподобия [26].

Результаты и обсуждение. Для валидации молекулярных маркеров ORS 662, ORS 509 и ORS 822 и определения их диагностической ценности были отобраны устойчивая ко всем расам линия RHA 419 и восприимчивые линии ВК 776 и ВК 925. Эти линии также отличаются по мик-росателлитным профилям от линии RHA 419 [25].

Как правило, SSR-маркеры имеют кодоминантное наследование, у гибридов F1 в микросателлитном профиле присутствуют фрагменты обоих родителей, однако бывают и исключения. Imerovski с соавторами сообщали, что локус ORS 509 имеет доминантное наследование [20]. Однако результаты нашего исследования поколения F1 показали, что он наследуется кодоминантно так же, как локусы ORS 662 и ORS 822. Так как техника искусст- венного скрещивания сводится к выполнению двух операций: кастрации цветков материнских линий и опылению их пыльцой, собранной с отцовских особей, не всегда достигается 100%-ная гибридность растений. Анализ ДНК позволяет достоверно определить негибридные растения и исключить их из дальнейшей работы. У полученных нами образцов поколения F1 по изучаемым локусам выявлены фрагменты обеих родительских линий. На рисунке 1 для примера представлена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК с праймером ORS 662. У образцов на дорожках 1-20 выявлены фрагменты обеих родительских линий, представленных на дорожках 21-24 и 2528. Аналогичный результат получен и с праймерами ORS 509 и ORS 822.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 М

Рисунок 1 – Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК образцов подсолнечника поколения F 1

по локусу ORS 662:

дорожки 1-5, 11-15 - RHA 419 х ВК 776;

6-10, 16-20 - RHA 419 х ВК 925, 21-22 - ВК 925,23 - ВК 776, 25-28 RHA 419, М - маркер молекулярного веса 100 bp (ориг.)

На основании полученных результатов из поколения F 1 было отобрано и само-опылено по пять растений для получения поколения F 2 . Анализ расщепления по устойчивости подсолнечника к ложной мучнистой росе для комбинаций скрещиваний RHA 419 х ВК 776 и RHA 419 х ВК 925, выполненный по результатам фитопатологической оценки, показал, что фактически наблюдаемое расщепление по фенотипу соответствовало теоретически ожидаемой модели 3 : 1 при моногенном наследовании признака. Для комбинации

RHA 419 x ВК 776 из 144 растений потомства F 2 пораженных растений было 38. А для комбинации RHA 419 x ВК 925 из 102 проанализированных растений пораженных было 18.

Критерий χ 2 , характеризующий соответствие фактических расщеплений теоретически ожидаемым, подтвердил доминантное моногенное наследование устойчивости для обеих комбинаций (табл. 1).

Таблица 1

Наследование признака устойчивости к ложной мучнистой росе в поколении F 2 при скрещивании линий подсолнечника

Ген Pl arg	Всего растений, шт.	Теоретически ожидаемое соотношение	χ 2	d f	P
RHA 419 x ВК 776	144	3 : 1	0,15 6	1	0 , 2 1
RHA 41 x ВК 925	102	3 : 1	3,794	1	0 , 3 4

Эти результаты согласуются с данными Wieckhorst с соавторами (2010), которые определили, что локус Pl arg контролируется одним геном и наследуется доминантно [18]. Это является как преимуществом, так и недостатком, поскольку устойчивость, обусловленная такими генами, быстро преодолевается.

Далее был проведен гибридологический анализ поколения F 2 для трех SSR- локусов. Результаты по оценке наследования SSR- локусов для комбинации скрещива ния RHA 419 x ВК 776 представлены в таблице 2.

Таблица 2

Наследование SSR-локусов ДНК ORS 509, ORS 662 и ORS 822 в F 2 при скрещивании линий RHA 419 и ВК 776

Локус	Всего растений, шт.	Теоретически ожидаемое соотношение	χ 2	d f	P
ORS 509	106	1 : 2 : 1	38,2	2	<0 ,05
ORS 6 62	1 13	1 : 2 : 1	14,9	2	<0 ,05
ORS 8 2 2	141	1 : 2 : 1	15,6	2	<0 ,05

Как видно из таблицы 2, все локусы показали несоответствие фактического 18

расщепления ожидаемому соотношению 1 : 2 : 1. В литературе описаны многочисленные примеры такого искажения расщепления. Такое явление наблюдается в 7 -13 % случаев при внутривидовых скрещиваниях. А в скрещиваниях культурных форм с дикорастущими видами встречается значительно чаще - от 23 до 90 % . Например, Imerovski с соавторами (2016) сообщали об искажении расщепления при скрещивании линий с другими генами устойчивости подсолнечника, происходящими из диких видов, например, гена устойчивости к заразихе or ab-vl-8 . В скрещиваниях восприимчивых линий подсолнечника с линией АВ -VL-8, происходящей из многолетнего дикорастущего вида H. divaricatus , несоответствие расщепления было в пользу аллелей от восприимчивой родительской линии либо наблюдался избыток гетерозигот. Согласно предположениям авторов, это происходит из - за того, что ген устойчивости лежит в области искажения сегрегации [27]. При картировании гена Pl arg в скрещиваниях восприимчивой линии с другим донором гена, интрогрессированным из H. argophyl l us , - линией Arg 1575-2, Du^le (2004) с соавторами отмечали похожее искажение расщепления. Из 126 растений поколения F 2 было получено 16 гомозиготных устойчивых, 82 гетерозиготных и 28 гомозиготных восприимчивых , и χ 2 был равен 13,6 [19].

Линия RHA 419, использованная в нашем исследовании, получена в результате скрещивания RHA 373 x Arg 1575- 2. И , несмотря на отсутствие соответствия фактических расщеплений теоретически ожидаемым в поколении F 2 , мы сделали тест на совместное наследование гена Pl arg с изучаемыми SSR- локусами. На рисунке 2 показаны электрофореграммы продуктов амплификации ДНК образцов подсолнечника поколения F₂ (RHA 419 x ВК 776), полученные с праймерами ORS 509 и ORS 662. По локусу ORS 509 изученные образцы распределились в пять классов. Это устойчивые и восприимчивые растения, имеющие фракцию размером 195 п.н. такую же , как у линии RHA

419 (рис. 2 a , дорожки 7, 12-15 и 17), восприимчивые растения с фракцией 189 п.н. , как у линии ВК 7 76 (рис. 2 a , дорожки 3, 5, 6, 8 -10, 16 и 18). Растения, имеющие фракции обоих родителей, были как среди устойчивых, так и восприимчивых (рис. 2 a, дорожки 4, 11). Не было выявлено устойчивых растений с фрагментом ДНК, как у восприимчивой линии ВК 776 . По локусу ORS 662 были выявлены четыре класса. В отличие от локуса ORS 50 9 не обнаружено восприимчивых растений с генотипом, как у линии RHA 419. Но среди устойчивых и восприимчивых также были растения, имеющие фракции обоих родителей. По локусу ORS 822 мы наблюдали шесть классов. Это устойчивые и восприимчивые растения, имеющие такую же фракцию, как у линии RHA 419 , восприимчивые растения с фракцией , как у линии ВК 7 76 . Растения , имеющие фракции обоих родителей, были как среди устойчивых, так и восприимчивых. Были выявлены устойчивые растения с фрагментом, как у восприимчивой линии ВК 776. Для отбора устойчивых гетерозиготных растений данные маркеры не применимы. Но их можно использовать для отбора гомозиготных устойчивых растений из расщепляющейся популяции.

(а)                        (b)

Рисунок 2 - Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК образцов подсолнечника поколения F ₂ (RHA 4 1 9 х ВК 776) в полиакриламидном геле: ( a ) по локусу ORS 509, дорожки : 1 - RHA 419,

2 - ВК 776, 3 - 1 8 - образцы подсолнечника поколения F 2 ; (b ) по локусу ORS 662 , дорожки 1 - 18 - образцы подсолнечника поколения F 2 , 19 - ВК 776, М - маркер молекулярного веса 100 bp (ориг.)

В таблице 3 представлены данные по оценке совместного наследования гена

Pl arg с SSR- локусами в потомстве F 2 (RHA 419 х ВК 776). Показаны значения % ² , а также вероятность нулевой гипотезы о независимом наследовании (P) между анализируемыми генами. Тест на совместное наследование показал сцепленное наследование гена Pl arg c локусами ДНК ORS 662, ORS 509 и ORS 822.

Таблица 3

Значения χ 2 между геном Pl arg и SSR-локусами в потомстве F 2 (RHA 419 × ВК 776)

Пара локусов	Всего растений, шт.	Фактически наблюдаемое соотношение, шт.	Теоретически ожидаемое соотношение	χ 2	df	P
Pl arg - ORS 6 6 2	113	46 : 3 3 : 0 : 0 : 12 : 22	3 : 6 : 3 : 1 : 2 : 1	89	5	<0,01
Pl ag - ORS 509	106	16 : 31 : 24 : 0 : 5 : 30	3 : 6 : 3 : 1 : 2 : 1	98	5	<0,01
Pl ag - ORS 82 2	141	35 : 68 : 1 : 13 : 9 : 15	3 : 6 : 3 : 1 : 2 : 1	42	5	<0,05

Была выполнена оценка частоты рекомбинации между парами локусов Pl arg - ORS 662, Pl arg - ORS 509 и Pl arg - ORS 822. Значения частот рекомбинации, представленные в таблице 4, подтвердили сцепление этих локусов. Частота рекомбинации между парами локусов Pl arg - ORS 662 составила 0,11 ± 0,03, Pl arg - ORS 509 - 0,23 ± 0,04 и Pl arg - ORS 8 2 2 - 0,31 ± 0,05 (табл. 4).

Таблица 4

Значения частот рекомбинации между геном Pl arg и локусами ORS 509, ORS 662 и ORS 822 в F 2 (RHA 419 × ВК 776)

Пара локусов	r	s p
Pl arg - ORS 509	0,23	0 ,04
Pl arg - ORS 662	0,11	0 ,03
Pl arg – ORS 8 2 2	0,31	0 ,05

На следующем этапе работы выполнили тест на совместное наследование гена Pl arg с SSR - локусами в потомстве F 2 (RHA 419 х ВК 925). Анализ расщепления ДНК - локусов в поколении F 2 для гибридной комбинации проводили только по двум локусам: ORS 509 и ORS 662. Искажения расщепления в данной комбинации не наблюдалось. Критерий χ 2 по этим локусам составил 3,7 и 4,6 соответственно при Р равном 0,25 (табл. 5).

Таблица 5

Наследование SSR-локусов ДНК ORS 509 и ORS 662 в потомстве F 2 при скрещивании линий RHA 419 и ВК 925

Локус	Всего растений, шт.	Теоретически ожидаемое соотношение	χ 2	df	P
ORS 509	106	1 : 2 : 1	3,7	2	0,25
ORS 662	102	1 : 2 : 1	4,6	2	0,10

Значения χ 2 между геном Pl arg и SSR - локусами в поколении F 2 для гибридной комбинации RHA 419 х ВК 925 показаны в таблице 6.

Таблица 6

Значения χ 2 между геном Pl arg и SSR-локусами в потомстве F 2 (RHA 419 × ВК 925)

Пара локусов	Всего растений, шт.	Фактически наблюдаемое соотношение, шт.	Теоретически ожидаемое соотношение	χ2	df	P
Pl arg – ORS 509	106	18 : 45 : 20 : 0 : 5 : 12	3 : 6 : 3 : 1 : 2 : 1	14,7	5	<0,01
Pl arg – ORS 662	102	17 : 45 : 22 : 0 : 8 : 10	3 : 6 : 3 : 1 : 2 : 1	12,1	5	<0,02

Тест на совместное наследование показал сцепленное наследование гена устойчивости c локусами ORS 509 и ORS 662. Частота рекомбинации составила 0,28 ± 0,05 для пары Pl arg - ORS 509 и 0,34 ± 0,05 для пары Pl_arg - ORS 662 (табл. 7)

Таблица 7

Значения частот рекомбинации между геном Pl arg и локусами ORS 509 и ORS 662 в потомстве F 2 (RHA 419 × ВК 925)

Пара локусов	r	s p
Pl arg - ORS 509	0,28	0,05
Pl arg - ORS 6 62	0,34	0,05

Результаты нашего исследования показали, что частоты рекомбинации между геном Pl arg и изученными локусами в обеих комбинациях скрещиваний отличались. Причем, если по локусу ORS 509 различия небольшие (0,23 и 0,28), то по ORS 662 они значительнее (0,11 и 0,34). А в исследовании Dußle с соавторами частота рекомбинации по локусу ORS 662

составила 1,9 [19]. В связи с этим мы считаем, что в практической селекции на устойчивость к P. halstedii необходимо применение нескольких молекулярных маркеров.

Многие авторы отмечают, что на оценку расстояния между локусами могут оказать влияние ошибки фенотипирования, потому что идентификация восприимчивого фенотипа как устойчивого при классификации приводит к увеличению класса рекомбинантных генотипов и искажает дистанции на генетической карте [18; 19]. А также на оценку расстояния между генами оказывает влияние еще и искажение расщепления в поколении F 2 у SSR- локусов. Такие данные показывают, что диагностическую ценность молекулярных маркеров необходимо проводить на большем количестве гибридных комбинаций.

Заключение. Таким образом, апробация молекулярных маркеров ORS 509, ORS 662 и ORS 822 гена Pl arg с использованием гибридных комбинаций линий подсолнечника RHA 419 х ВК 776 и RHA 419 х ВК 925 показала, что маркерные аллели в реципиентных линиях ВК 776 и ВК 925 отличались от аллелей линии RHA 419. Изученные микросателлитные локусы наследуются кодоминантно. Ген устойчивости и SSR- локусы наследуются сцеплено. С точки зрения практического их использования в маркерной селекции предпочтительно применять все три локуса ORS 509, ORS 662 и ORS 822, чтобы минимизировать ошибки при отборе устойчивых растений.