Оценка токсичности бактериальной нуклеазы, проведенная в остром эксперименте

Бактериальная нуклеаза – это фермент, который синтезируют и секретируют в окружающую среду грамотрицательные бактерии Serratia marcescens. При физиологических условиях нуклеаза успешно расщепляет ДНК или РНК на нуклеотиды [3]. В настоящее время бактериальная нуклеаза – это хорошо изученный фермент, у которого известны ключевые физикохимические и биохимические свойства, структура и механизм действия [7, 10]. Данные о нуклеазе представлены в таких известных банках данных как SCOP, RCSB, Brenda. Разработаны методы выделения и очистки фермента [12]. Известны биологические эффекты (Таблица 1). Так, показан ее противоопухолевый эффект. При внутрибрюшинном введении нуклеазы в дозе 0,25 мг/кг живой массы мышей происходило торможение развития внутрибрюшинной карциномы Эрлиха более чем на 50 % [1]. Нуклеаза очень активна при деградации ДНК в мокроте [13], приближаясь по эффективности к медицинскому препарату Пульмозим, применяемому при лечении болезней дыхательной системы. Установлен антирабический эффект композиции материалов, ключевым компонентом которой является бактериальная нуклеаза [8]. Под названием Эндовираза (Эндоглюкин) препарат на основе бактериальной нуклеазы применяют в сельском хозяйстве для лечения и профилактики вирусных заболеваний пчел [6]. Показана эффективность Эндовиразы в борьбе с вирусными респираторными инфекциями крупного рогатого скота и птицы [2, 4]. Однако в печати нет сведений, позволяющих охарактеризовать этот фермент токсикометрически. Сведения о невысокой цитотоксичности бактериальной нуклеазы, полученные с использованием ряда культур клеток (Таблица 2), являются недостаточными для токсикометрической характеристики данного вещества. Известно, что начальным этапом для токсикометрической характеристики вещества обычно служит оценка его острой токсичности в опытах in vivo. Учитывая реальное применение бактериальной нуклеазы на практике и его дальнейшие перспективы, цель настоящего исследования заключалась в выявлении токсических эффектов бактериальной нуклеазы в остром эксперименте, но без достижения летальности. В связи с этим нуклеазу использовали в количестве близком к дозе, соответствующей дозе для проявления ее биологических эффектов (Таблица 1).

Материал и методы исследований. Объектом исследования служила гомогенная бактериальная нуклеаза, которую получали выделением из культуральной жидкости S.marcescens и характеризовали чистоту препарата, как описано [11]. Очищенную нуклеазу затем диализовали против дистиллированной воды и лиофилизировали. После этого 1 мг сухой нуклеазы растворяли в 0,2 мл физиологического раствора и центрифугировали при 4 °С для удаления не растворившейся фракции. Концентрацию раствора нуклеазы рассчитывали исходя из поглощения надосадочной жидкости при 280 нм и молярного коэффициента экстинкции 47 292 М-1/см2 [12].

Таблица 1 – Биологические эффекты нуклеазы

Таблица 2 – Условия определения цитотоксичности бактериальной нуклеазы in vitro

Ферментативную активность определяли методом, основанным на оценке количества кислоторастворимых низкомолекулярных нуклеотидных фрагментов, образуемых при деградации субстрата (ДНК или РНК) под действием нуклеазы [3].

Испытание токсичности проводили в соответствии с методическими указаниями [5] на половозрелых самцах белых мышей с массой тела 20-21 г, сформированных в 4 группы: контрольную и три опытные (n=5). Основными критериями включения животных в эксперимент было отсутствие клинических признаков заболеваний. После формирования групп грызуны были подвергнуты двухнедельному карантину для последующей оценки их адаптации и физиологического состояния. Содержание животных осуществляли в типовых пластиковых клетках с температурным режимом +18-22 °С в условиях естественного светового цикла на стандартной диете, без ограничений к потреблению пищи и воды.

Дизайн эксперимента был разработан в соответствии с действующими правилами Европейской Конвенции (2010/63/EU) по уходу и защите животных, используемых для исследовательских и иных научных целей, и одобрен Комитетом по этике Казанского федерального университета (Российская Федерация, г. Казань, № 459.06.04.2020).

Объект исследования вводили мышам в хвостовую вену по 0,05 мл/мышь, руководствуясь тем, что кровь, циркулируя по организму, омывает все органы и ткани. Мышам контрольной группы вводили физиологический раствор (физраствор), а опытных групп – по 10,5 мкг нуклеазы в физрастворе/мышь, то есть в дозе 0,5 мг/кг веса животного. Для дальнейшего анализа животных умерщвляли эвтаназией в атмосфере углекислого газа сразу после введения нуклеазы – 1-я опытная группа, через 2 ч после введения – 2-я опытная группа и через 2 недели после введения – 3-я опытная группа – и подвергали вскрытию для исследования органов. Параллельно получали сыворотку крови для анализа динамики изменения содержания нуклеазы в крови, для чего оценивали изменение ДНКазной и РНКазной активностей сыворотки крови, отобранной из сердца животного сразу после начала эвтаназии, но до остановки сердца. Сыворотку выделяли в соответствии с общепринятым методом. Для образования сгустка кровь инкубировали 60 мин. при 25 oC. Затем сгусток удаляли и клетки крови отделяли 10-мин. центрифугированием при 1300 g. Полученные сыворотки хранили при температуре – 20 °С.

Острую токсичность оценивали по таким показателям как клиническое состояние, поведенческая активность, возможная количественная гибель мышей и сроки ее наступления. Контроль за животными и наблюдение для выявления признаков токсикоза продолжали в течение 14 суток от момента введения нуклеазы. В первые сутки учет физиологического состояния проводился каждый час; следующие трое суток – каждые 8 часов; в оставшиеся дни оценка состояния мышей осуществлялась каждые 24 часа.

Данные, полученные в результате исследования, обработаны биометрически с использованием пакета стандартных программ Microsoft Excel.

Результат исследований. В эксперименте была использована гомогенная бактериальная нуклеаза, выделенная, как описано ранее, и охарактеризованная с помощью SDS-PAGE и полносканирующей масс-спектрометрии MALDI-TOF [13]. Ферментативная активность растворенной фракции составляла 389333,3 Ед/мл в час с РНК в качестве субстрата и 294666,6 Ед/мл в час с ДНК. Концентрация нуклеазы перед инъекцией составляла 0,21 мг/мл.

Оценка активности ДНКазы и РНКазы в образцах сыворотки до и после введения нуклеазы мышам показала, что и ДНКазная и РНКазная активности были определены в сыворотке на всех этапах исследования (Рисунок 1). Однако, до введения мышам нуклеазы (контрольная группа) ДНКазная и РНКазная активности соответствовали 30 и 190 Ед/мл в час. Сразу после внутривенного введения нуклеазы (1-я опытная группа) обе активности в сыворотке резко возрастали: соответственно в 350 и в 130 раз. А через два часа после введения нуклеазы (2-я опытная группа) обе активности в сыворотке снижались примерно в 25 и 30 раз, но оставались в 5-10 раз выше, чем в контроле. По истечению 14 суток (3-я опытная группа) показатели РНКазной и ДНКазной активностей сыворотки соответствовали контролю (результаты не показаны).

Таким образом, в сыворотке контрольных мышей по сравнению с вводимым ферментом обе активности были невелики. Сразу после внутривенного введения нуклеазы обе активности в сыворотке резко увеличивались, вероятно, за счет распределения по крови бактериальной нуклеазы. И через два часа после введения нуклеазы (2-я опытная группа) обе активности в сыворотке существенно снижались, но оставались выше, чем в контроле. Повышенные по сравнению с контролем ДНКазная и РНКазная активности сыворотки предполагали наличие в крови остаточных количеств бактериальной нуклеазы. При этом многократное снижение этих активностей спустя 2 ч после введения бактериальной нуклеазы могло быть связано или с протеолизом нуклеазы за счет собственных протеаз сыворотки или с перераспределением бактериальной нуклеазы между кровью и другими тканями мышей, что требует дальнейшего исследования.

Рисунок 1 – ДНКазная (темные столбики) и РНКазная (светлые столбики) активности в сыворотке крови до введения нуклеазы (контроль), сразу после введения (1-я опытная) и через 2 ч (2-я опытная) после введения нуклеазы в хвостовую вену мышей

При оценке состояния животных по результатам проведенных исследований признаков интоксикации и случаев гибели мышей при однократном введении бактериальной нуклеазы в разовой дозе 0,5 мг/кг веса животного выявлено не было ни сразу, ни через 2 ч, ни через 14 суток после введения. На протяжении всего срока наблюдений общее состояние животных опытных и контрольной групп не различалось, не наблюдалось никаких грубых патологий. Поведенческие реакции не отклонялись от нормы. Реакции на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители были без патологических изменений. Ни у одной мыши не наблюдалось значительных поведенческих изменений, таких как изменение двигательной функции, уровня возбуждения, вегетативных функций и психологического статуса, которые могли бы указывать на эффект нейротоксичности. Отсутствовало влияние введения нуклеазы на аппетит: потребление еды и воды оставалось нормальным, истощение не выявлялось, что свидетельствовало об отсутствии нарушения углеводного, белкового или жирового обменов.

Вскрытие животных как опытных, так и контрольной групп показало, что грудная и брюшная полости не содержали выпота; положение внутренних органов грудной и брюшной полостей анатомически правильное, париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие. Никаких гистологических изменений в печени, почках, селезенке, сердце, легких мышей, подвергшихся инъекции нуклеазы, не наблюдалось. Состояние волосяного и кожного покровов, окраска слизистых были без патологических изменений: отека, гиперемии, язв, сыпи. Шерсть была блестящей, без очагов аллопеции, зубы сохранены, видимые слизистые оболочки бледно-розовые, блестящие, деформации или отека конечностей не выявлено. Таким образом, оценка токсичности бактериальной нуклеазы, проведенная в остром эксперименте, позволяет заключить, что данный фермент в дозе 0,5 мг/кг веса животного не проявляет органотоксичности.

Заключение. Данные токсикометрии при внутривенном введении бактериальной нуклеазы, а также наблюдение за лабораторными мышами на протяжении 14 суток в постинтоксикационном периоде позволяют заключить, что бактериальная нуклеаза, введенная внутривенно мышам в дозе 0,5 мг/кг веса животного не вызывала острых побочных эффектов на внешний вид и поведение мышей, что свидетельствовало об отсутствии токсичности нуклеазы in vivo в выбранной дозе.

Работа выполнена за счет средств Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИОРИТЕТ-2030).