Оценка тромбоцитарной активности в модели создания дислипидемии у крыс разного возраста

Введение. Вторая половина онтогенеза у млекопитающих и человека нередко протекает с развитием патологии, имеющей весьма выраженную, генетически обусловленную основу [1], что в итоге ведет к гибели организма [2]. Возрастные изменения в числе прочего способны негативно влиять на реологические свойства клеток крови [3–5] и активность системы гемостаза [6], нередко вызывая в организме тромбофилическую ситуацию [7, 8].

В настоящее время физиология и медицина уделяют большое внимание изучению ранних этапов развития различной патологии и начальных механизмов ее реализации [9]. Большой интерес проявляется исследователями к функциональным и реологическим особенностям различных форменных элементов крови [10–12]. Установлено, что они играют большую роль в функционировании системы гемостаза при различной патологии, в т.ч. при весьма распространенных в настоящее время сердечно-сосудистых и ведущих к ним обменных заболеваниях [13, 14]. Среди них во всем цивилизованном мире одну из лидирующих позиций занимает атеросклероз, приводящий к широкой инвалидизации населения и вносящий существенный вклад в показатели смертности лиц трудоспособного возраста [15]. Было замечено, что при развернутой клинической картине обменных нарушений, ведущих к прогрессированию атеросклероза, наблюдаются высокая активность тромбоцитов [16] и ослабление сосудистого контроля над ними. Данная ситуация существенно активирует гемостаз, снижает эффективность микроциркуляции и интенсивность обмена веществ во всех тканях [17]. Вместе с тем гемостатические ха- рактеристики тромбоцитов на самых ранних этапах развития дислипидемии, ведущей к атеросклерозу, остаются недостаточно изученными.

Учитывая, что поверхность активированных тромбоцитов является «плацдармом» для всех процессов гемостаза, способного в условиях ослабления с возрастом дезагрегацион-ных механизмов [19] привести к окклюзии различных сосудов [18], представляет большой практический интерес проведение экспериментальных работ по подробному изучению влияния дислипидемии на тромбоцитарную активность. Большую трудность для клиницистов и патофизиологов представляет возможность проследить наиболее ранние этапы возникновения гемостатических нарушений тромбоцитов на человеке в виду частого выпадения из поля зрения медиков лиц с первыми признаками дислипидемии. Это диктует потребность проведения экспериментальных исследований на лабораторных животных с моделированием у них дислипидемии на разных этапах второй половины онтогенеза.

Цель исследования. Выяснить зависимость активности тромбоцитов от возраста экспериментального создания дислипидемии у крыс.

Материалы и методы . В исследование включено 105 здоровых экспериментальных крыс-самцов (34 крысы – 12 мес. возраста, 32 крысы – 18 мес. возраста, 39 крыс – 24 мес. возраста), у которых алиментарным путем формировали дислипидемию. Крысы помещались в тесные клетки по 1 особи на 30 сут и начинали получать высококалорийную диету, состоящую из комбикорма (47 %), сладкого сгущенного молока (44 %), растительного масла (8 %) и растительного крахмала (1 %), что обеспечило следующий состав их рациона: жиры – 29,6 %, протеины – 14,8 %, углеводы – 55,6 % [20].

Группу контроля составила 91 здоровая краса-самец, в т.ч. 30 животных – 12 мес. возраста, 32 крысы – 18 мес., 29 животных – 24 мес. возраста. Они получали комбикорм производства «Лабораторкорм» (Россия) в полном объеме и не подвергались воздействиям. Все животные были здоровы на протяжении всего времени, предшествовавшего взятию под наблюдение, и ранее не участвовали ни в каких экспериментах.

Концентрация общего холестерина (ОХС) и триглицеридов (ТГ) определялась энзиматическим колориметрическим способом с использованием набора «Витал Диагностикум». Содержание в плазме ХС липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) выясняли при помощи набора «Ольвекс Диагностикум» энзиматическим колориметрическим способом. Концентрацию ХС липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) устанавливали расчетным путем по формуле W. Friedwald et al. (1972). Концентрацию ХС липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) вычисляли, используя формулу ХС ЛПОНП=концентрация ТГ/2,2.

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) плазмы оценивали по содержанию тиобарбитуровой кислоты (ТБК)-активных продуктов набором «Агат-Мед» и ацилгидроперекисей (АГП) с учетом антиокислительной активности (АОА) плазмы. Количество тромбоцитов в капиллярной крови определяли в камере Горяева. Агрегацию тромбоцитов (АТ) выясняли визуальным микрометодом [21] с использованием в качестве индукторов АДФ (0,5 x 10 -4 М), коллагена (разведение 1:2 основной суспензии), тромбина (0,125 ед./мл), ристомицина (0,8 мг/мл), адреналина (5 x 10 -6 М) и перекиси водорода (7,3 x 10 -3 М), а также сочетаний АДФ и адреналина, АДФ и коллагена, адреналина и коллагена. Оценку учитываемых показателей в обеих группах животных проводили однократно. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. У наблюдаемых опытных и контрольных крыс всех возрастов перед началом исследований отсутствовали различия по всем учитываемым показателям. По мере увеличения возраста в контроле отмечено достоверное повышение количества АГП и ТБК-продуктов в плазме при понижении ее АОА. У экспериментальных крыс формирование дислипидемии сопровождалось большей ее выраженностью, нарастанием активности ПОЛ плазмы и уменьшением ее антиоксидантной защиты. При этом по мере увеличения возраста животных эти изменения углублялись, значительно превы- шая выраженность возрастных изменений в контроле. Так, при формировании дислипидемии у крыс в возрасте 24 мес. уровень ПОЛ у них оказался наибольшим: АГП – 2,460±0,018 Д233/1 мл, ТБК-активные продукты – 5,380±0,026 мкмоль/л, – при наименьшей АОА (20,10±0,32 %). У контрольных 24 мес. крыс данные показатели составили 1,950±0,033 Д233/1 мл, 4,220±0,042 мкмоль/л и 26,20±0,27 % соответственно (табл. 1).

Концентрации кровяных пластинок у крыс в возрасте 12 мес. в опытной и контрольной группах были сходными. В группе контроля по мере увеличения возраста отмечено некоторое нарастание активности АТ в ответ на все агонисты и их комбинации. Активнее всего АТ развивалась у этих животных под влиянием коллагена, позднее АТ наступала с ристомицином, Н2О2 и АДФ, еще позднее – с тромбином. Наиболее поздняя АТ у контрольных крыс во всех возрастах отмечена под действием адреналина. Комбинации индукторов у них способствовали их взаимо-потенциированию и ускорению АТ, обеспечивая ее возникновение почти вдвое быстрее, чем с отдельными индукторами (табл. 1).

Таблица 1

Биохимические и гематологические показатели у крыс второго года жизни на фоне экспериментального создания у них дислипидемии

Примечание. Достоверные различия между экспериментальными и контрольными животными внутри их возрастной группы: * – р<0,05; ** – р<0,01 .

У экспериментальных животных отмечено прогрессивное ускорение АТ, связанное с увеличением возраста формирования у них дислипидемии. Чем больше был возраст взятого в эксперимент животного, тем более активно его тромбоциты реагировали на все индукторы и их комбинации, что значимо превышало их возрастные изменения в контроле. При этом во всех учтенных возрастах наиболее активно тромбоциты животных с развившейся дислипидемией реагировали на коллаген и АДФ, чуть слабее – на Н 2 О 2 и ристомицин, еще менее активно – на тромбин и адреналин. Длительность АТ у крыс, имеющих алиментарно вызванную дислипидемию, в ответ на сочетания индукторов также достоверно превышала контроль, нарастая по мере увеличения возраста животных.

При экспериментальном создании у крыс дислипидемии отмечены весьма свойственные для человека [7, 8] гиперхолестеринемия и гипертриглицеридемия, ослабление антиоксидантного потенциала плазмы, сопровождающиеся постепенным повышением в ней количества АГП и ТБК-активных соединений и неизбежным ухудшением метаболизма в тканях. Кроме того, активация процессов ПОЛ в плазме вызывала альтерацию поверхностных структур форменных элементов крови [22], в т.ч. наиболее гемостатически значимой их популяции – тромбоцитов, что весьма негативно сказывалось на их функциях.

Формирующиеся в эксперименте изменения в липидном составе плазмы нарушали соотношение между фракциями липидов мембран тромбоцитов, способствуя активации в них ПОЛ. Это быстро изменяло у модельных крыс активность рецепторных и пострецепторных механизмов функционирования тромбоцитов. Возникающий липидный дисбаланс в их организме приводил также к отрицательной динамике в регуляции в тромбоцитах ионного и антиоксидантного статуса, что обеспечивало негативные изменения их метаболизма и структурно-функциональных свойств в сосудах [2].

Увеличение у экспериментальных крыс чувствительности тромбоцитов к индукторам агрегации обеспечивалось активацией ряда механизмов. Так, на поверхности их тромбоцитов постепенно повышалась плотность гликопротеидов (GP) Iа–IIа и VI, участвующих в адгезии кровяных пластинок, о чем можно было судить по интенсификации АТ в ответ на коллаген [2]. Наступающее усиление адгезии кровяных пластинок у экспериментальных крыс следует связать также с избыточной экспрессией рецепторов к фактору Виллебранда на их поверхности. Данный механизм усиления адгезивной активности тромбоцитов у этих крыс удалось зарегистрировать по интенсификации АТ с ристоми-цином, влияющим на тромбоциты идентично субэндотелиальным структурам сосудов. Учитывая, что для наступления ристомици-новой АТ необходим фактор Виллебранда, фиксирующийся одной стороной молекулы к ристомицину (как к коллагену), а второй – к кровяным пластинкам через их рецептор Iв, у экспериментальных крыс можно было констатировать усиление образования «оси адгезии»: ристомицин (коллаген) – фактор Виллебранда – GP Iв. При этом именно значительное повышение количества мест связывания фактора Виллебранда на мембранах кровяных пластинок у экспериментальных крыс является важным механизмом наступления у них чрезмерной адгезивной способности тромбоцитов [23].

Нарастание чувствительности тромбоцитов к коллагену с возрастом у экспериментальных крыс следует связывать с повышением на поверхности кровяных пластинок количества рецепторов к нему, потенции-рующимся сочетанием возрастных изменений и дислипидемии. Это неизбежно сопровождалось активацией фосфолипазы С, стимуляцией синтеза диацилглицерола и проте-инкиназы С с последующим выраженным фосфолирированием протеинов сократительной системы [18]. В этих условиях инозитолтрифосфат все активнее стимулировал поступление Са2+ из депо кровяных пластинок, способствуя стремительному сокращению актомиозина, что наиболее выраженно проявлялось в самом старшем возрасте.

Индуктор АДФ, относящийся к слабым индукторам агрегации тромбоцитов, все более активно в ходе реализации модели стимулировал кровяные пластинки. Это происходило за счет активного его взаимодействия с нарастающим количеством рецепторов к нему на тромбоцитарных мембранах у экспериментальных крыс по мере увеличения их возраста. Это вызывало на поверхности тромбоцитов постепенно усиливающуюся с возрастом экспрессию фибриногеновых рецепторов с активацией фосфолипазы А 2 , обеспечивающей выщепление арахидоновой кислоты из мембранных фосфолипидов [6].

Выявленное увеличение с возрастом АТ в ответ на сочетания индукторов у экспериментальных крыс косвенно указывало на повышение в их крови при формировании дислипидемии уровня индукторов агрегации (тромбина, АДФ, адреналина), достоверно превышающего динамику такового в контроле. Это следует расценивать как повы-шениес возрастом активности их рецепторов, более выраженное у экспериментальных крыс, чем у контрольных. Нарастание в крови способности к агрегации на фоне экспериментального создания дислипидемии также связано с усилением возрастных изменений на фоне развития чрезмерной экспрессии на мембранах фибриногеновых рецепторов (GP IIв – IIIа).

Заключение. Создание у крыс разного возраста дислипидемии показало ослабление антиоксидантной защиты плазмы и усиление в ней ПОЛ, которые углублялись по мере увеличения возраста животных, взятых в эксперимент. Развивающиеся нарушения у экспериментальных крыс превышали возрастные изменения активности тромбоцитов в контроле. Становится ясно, что по мере увеличения возраста необходимо все более строго контролировать уровень липидов крови и избегать создания в организме дислипидеми-ческой ситуации, с годами все в большей степени активирующей кровяные пластинки и повышающей риск развития тромбофилии.