Оценка взаимосвязи экспрессии гена ликопин-e-циклазы LCYE с содержанием b-каротина и хлорофиллов в вегетативной ткани кукурузы

Кукуруза ( Zea mays L.) - важная сельскохозяйственная культура, одним из ценных признаков которой считается биосинтез предшественников витамина А в зерне и фотосинтезирующей ткани. Количество провитамина А в зерне находится в зависимости от экспрессии гена ликопин-ε-циклазы LcyE , катализирующей образование α-каротина и участвующей в регуляции соотношения ветвей b-b и b-e пути метаболизма каротиноидов. В настоящей работе впервые выявлено отсутствие ассоциаций между окраской зерна и содержанием суммы каротиноидов и β-каротина в листьях кукурузы, установлено наличие положительной связи между количеством β-каротина и хлорофиллов a и b, определена обратная зависимость между содержанием β-каротина и хлорофиллов a и b и уровнем экспрессии гена LycE . Целью работы был анализ корреляционной связи содержания суммы каротиноидов, β-каротина и хлорофиллов а и b с экспрессией гена LcyE в листьях инбредных линий кукурузы отечественной селекции. В работе использовали четыре инбредные линии кукурузы: три белозерные (6097-1, МБК, Тетраплоид Шумного) и одну (5580-1) с желтой окраской зерна. Зерна проращивали в увлажненной почве при 23/25 °С и режиме 16/8 ч (день/ночь) до появления 4-го настоящего листа. Суммарную РНК выделяли из 50-100 мг ткани листьев и использовали для синтеза кДНК (GoScriptтм Reverse Transcription System, «Promega», США). Экспрессию гена LcyE в листьях определяли методом количественной ПЦР в реальном времени с нормализацией данных по референсному гену Zea mays polyubiquitin (NM_001329666.1; праймеры ZmUBI-rtF: 5´-ATCGTGGTTGTGGCTTCGTTG-3´, ZmUBI-rtR: 5´-GCTGCAGAAGAGTTTTGG-GTACA-3´). Для реакции использовали 3 нг кДНК-матрицы, кДНК-специфичные праймеры (ZmLcyE-F: 5´-TTTACGTGCAAATGCAGTCAA-3´, ZmLcyE-R: 5´-TGACTCTGAAGCTAGAGAAAG-3´), набор Реакционная смесь для проведения РВ-ПЦР в присутствии SYBR GreenI и ROX (ООО «Синтол», Россия) и термоциклер CFX96 Real-Time PCR Detection System («Bio-Rad Laboratories», США). Проводили количественное определение содержания суммы каротиноидов, хлорофиллов а и b и β-каротина в листьях. Растительную ткань (0,2 г) гомогенизировали в растворе Фолча (хлороформ:метанол, 2:1 v/v) в присутствии следовых количеств Mg2CO3, инкубировали 1 ч при 4 °С в водяной бане со льдом и центрифугировали 10 мин при 4000 об/мин и 4 °С (центрифуга Eppendorf 5418 R, «Eppendorf», Германия). Собирали хлороформную фазу и измеряли содержание ликопина, β-каротина, суммы каротиноидов, хлорофиллов а и b. Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах Eppendorf BioSpectrometer® basic («Eppendorf», Германия) и Cary 50 («Agilent Technology», США). Количество пигментов рассчитывали по соответствующим формулам. Корреляции между содержанием пигментов и экспрессией гена LcyE оценивали с помощью статистических методов. Самое высокое содержание каротиноидов было выявлено в листьях линии Тетраплоид Шумного. Образцы остальных трех линий синтезировали меньшее количество каротиноидов и были сходны между собой по этому параметру. В листьях линии 6097-1 было обнаружено приблизительно в 2 раза больше β-каротина и хлорофиллов a и b, чем у других анализируемых линий, несущественно различающихся между собой по количеству пигментов. Поскольку β-каротин служит предшественником ксантофиллов основного ксантофиллового цикла фотозащиты растений, можно говорить о повышенной скорости фотосинтеза в фотосинтезирующих тканях линии 6097-1 в сравнении с другими анализируемыми линиями. Соответственно, линия 6097-1 может обладать повышенной устойчивостью к оксидативному стрессу, а также служить донором признака повышенного содержания провитамина А (как силосная культура). Также установлено, что в листьях линий 5580-1 и Тетраплоид Шумного экспрессия гена LycE в ~ 4-5 раз выше, чем у линий МБК и 6097-1. Корреляционный анализ показал обратную зависимость между содержанием β-каротина и хлорофиллов a и b и уровнем экспрессии гена LycE . На основании полученных результатов мы предполагаем, что данные экспрессии гена LycE могут быть использованы в качестве экспрессионного молекулярного маркера количества провитамина А, синтезируемого в листьях кукурузы, а также при оценке степени устойчивости растения к фотоокислительному стрессу.