Оценка защиты миокарда методом лазерно-индуцированной флуоресценции на этапах коррекции врожденных пороков сердца у детей первого года жизни при применении раствора "Custodiol"

Изучение вопросов адекватности защиты миокарда у детей первого года жизни с использованием современных лабораторных методов крайне актуально и способствует профилактике послеоперационных осложнений. C целью оценки эффективности кардиопротекции до настоящего времени использовался анализ ультраструктуры кардиомиоцитов методом электронной микроскопии при операциях АКШ [4, 6], а также при коррекции ВПС [5, 8]. Проблема оценки состояния миокарда с использованием расширенного арсенала методик и введением новых морфологических характеристик по-прежнему актуальна [2, 3]. Апоптоз клеток миокарда при экспериментальном стенозе коронарных артерий регистрировался иммуногистохимическими методами [10, 11]. В нашем институте метод лазерно-индуцированной флуоресценции использовался в экспериментальных моделях для оценки жизнеспособности миокарда изолированного сердца как критерий подготовленности к трансплантации [7]. Для визуализации ДНК использовался этидиум бромид. Установлено, что снижение интенсивности флуоресценции скорее всего связано с потерей ядерного материала, так как динамика этого показателя носила однонаправленный характер по мере нарастания гипоксии [7]. Повреждение ДНК кар-диоцитов происходит и в результате действия эндонуклеаз, которые активируются при повышении концентрации внутриклеточного Ca2+, наблюдаемом в ходе окислительного стресса [7]. Активные формы кислорода (АФК) вызывают повреждения ДНК - происходят разрывы цепей, повреждения хромосом [1]. В экспериментальных моделях хронической ишемии миокарда при оценке структуры кардиоцитов методом лазерно-индуцированной флуоресценции наблюдалась фрагментация ДНК, что авторами ассоции ровалось с апоптозом [9,12] и не расценивалось как гибель кардиоцитов [12]. Участки фрагментированного ДНК, по видимому, далее подвергаются фагоцитозу [12]. В доступных нам информационных источниках работ по вопросам оценки адекватности защиты миокарда на этапах коррекции ВПС методом лазерно-индуцированной флуоресценции с анализом степени интраоперационного повреждения ДНК на аноксическом и реперфузионном этапах нами не найдено.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Обследовано 12 пациентов с ВПС (ДМЖП+ЛГ - 5, АВК - 4, ТФ - 2, ДОМС от ПЖ - 1). Средний возраст -11±0,7 месяцев. Исследования проводились на следующих этапах: до окклюзии аорты (Ао) - первый, во время пережатия Ао - второй, 20-30-я минута реперфузии - третий. Для защиты миокарда использовался раствор «Custodiol», средняя продолжительность окклюзии Ао - 60,0±3,8 мин; искусственного кровообращения (ИК) - 112,1±5,4 мин. Трое пациентов имели летальный исход.

Забор биопсии из ушка правого предсердия производили на следующих этапах операции: 1) непосредственно перед пережатием Ао, 2) после открытия Ао, 3) на 20-30-й минуте реперфузии. Изготавливали криостатные срезы и фиксировали этидиумом бромидом.

Оценка результатов проводилась на люминесцентном компьютеризированном микроскопе с определением интенсивности флуоресценции и с последующим вычислением процентного соотношения фрагментированного ДНК в ядре и в цитоплазме кардиоцитов. Для точности измерения в биоптате выделяли от трех до пяти зон, включающих в общей сложности до 400 кардиоцитов. Мы наблюдали различную интенсив- ность флуоресценции в биоптатах различных пациентов и четкую однонаправленность динамики показателя относительно исследуемых этапов у каждого в отдельности. Учитывая возможность ошибки, которая возникает при покраске и хранении материала, мы нормировали оценку, применив показатель процентного соотношения содержания фрагментированной ДНК в ядре и цитоплазме кардиоцитов.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета статистических программ Statistica 6.0. В качестве достоверных считали результаты при достижении уровня значимости р<0,05, для характеристики тенденции указывали уровень p<0,1. Методы статистики: непараметрический коэффициент корреляции Спирмана (rho), достоверность различия средних значений между двумя группами оценивали непараметрическим критериями Манна-Уитни, Уилкоксона. Если число сравниваемых групп превышало две, использовали непараметрический тест Краскелла-Уоллиса, для сравнения средних значений использовался критерий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Абсолютные показатели интенсивности флуоресценции кардиоцитов на 1,2 и 3 этапах коррекции ВПС представлены в табл. 1. Мы наблюдали наличие флуоресценции как в ядре, так и в цитоплазме кардиоцитов. При анализе динамики процентного соотношения интенсивности флуоресценции в цитоплазме кардиоцитов относительно ядра между 1 и 2, а также между 1 и 3 этапами операции достоверных различий не найдено (табл. 2). Корреляционной зависимости исследуемого показателя с длительностью окклюзии Ао не обнаружено (корреляционный анализ по Спирману). Вид сохранного миокарда при оценке структуры ДНК методом лазерно-индуцированной флуоресценции на 2 и 3 этапе операции представлен на рис. 1. Вид миокарда при частичном повреждении ДНК на этапе аноксии и реперфузии представлен на рис. 2.

У одного пациента с неблагоприятным исходом зарегистрировано соотношение показателя ядро-цитоплазма, приближающееся к 1:1 на 2 и 3 этапах операции (рис. 3).

Таблица 1

Средние значения интенсивности флюоресценции фрагментов ДНК в ядре и цитоплазме кардиоцитов на этапах коррекции ВПС при защите миокарда раствором «Custodiol»

Этап		N	Среднее значение	Min	Max	Стандартное отклонение	Ошибка среднего
	АО	34	60,47	25,00	87,00	22,06	3,78
	ИК	34	112,09	53,00	157,00	31,36	5,38
1	ядро	18	121,94	41,00	277,00	83,36	19,65
	цитоплазма	18	68,39	27,00	156,00	43,30	10,21
2	ядро	23	168,65	49,00	307,00	93,83	19,56
	цитоплазма	23	104,26	26,00	215,00	63,96	13,34
3	ядро	13	98,69	37,00	285,00	73,06	20,26
	цитоплазма	13	58,46	23,00	194,00	49,24	13,66

Таблица 2

Показатели процентного и относительного содержания фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов относительно клеточного ядра на этапах коррекции ВПС при защите миокарда раствором «Custodiol»

Этап	N	Среднее	Медиана	Min	Max	Стандартное отклонение	Ошибка среднего
Ядро/цитоплазма 1	18	0,62	0,57	0,22	1,00	0,21	0,05
%	18	62,04	56,82	22,13	100,00	21,32	5,02
Ядро/цитоплазма	23	0,61	0,61	0,41	0,82	0,11	0,02
2 %	23	61,14	60,51	40,74	82,00	10,73	2,24
Ядро/цитоплазма	13	0,57	0,56	0,44	0,72	0,09	0,03
%	13	57,20	55,56	43,86	72,31	9,35	2,59

Рис. 1. Сохранный миокард.

Рис. 2. Миокард поврежден частично.

Рис. 3. Поврежденный миокард.

Клинический анализ течения ближайшего послеоперационного периода показал следующие особенности:

• 1.    Тип восстановления сердечной деятельности - трое пациентов из 12 через атриовентрикулярный (A-V блок), двое - через дефибрилляцию с восстановлением синусового ритма.

• 2.    Нарушения ритма - блокада правой ножки пучка Гиса - 5, транзиторный A-V блок - 1, полный A-V блок с асистолией желудочков (проводилась постоянная электрокардиостимуляция) -1.

• 3.    Ухудшение метаболизма миокарда в ближайший послеоперационный период не зарегистрировано.

• 4.    Инотропная поддержка у пациентов с благоприятным исходом - средние дозы двух кардиотоников до двух суток.

• 5.    Нарушения сократимости миокарда не зарегистрировано.

• 6.    Причины летальности: сердечная недостаточ-ность+ легочная гипертензия (ЛГ) III стадии -2, полная A-V блокада с асистолией желудочков - 1.

ОБСУЖДЕНИЕ

Исследования по разработке интраоперационных критериев адекватности защиты миокарда при коррекции ВПС у детей первого года жизни, а также по вопросам метаболизма незрелого миокарда, перенесшего состояние аноксии и реперфузии, обсуждаются в отечественных и зарубежных работах [5, 8]. В цитируемых источниках оценка ультраструктурных изменений при кардиопротекции проводилась по митохондриальному индексу и содержанию гликогена в кардиоцитах. Нами впервые использован метод лазерно-индуцированной флуоресценции для определения степени дефрагментации ДНК при защите миокарда раствором «Custodiol». Нами использован показатель процентного содержания фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов относительно ядра. При использовании нами метода лазерно-индуцированной флуоресценции установлено, что при применении раствора «Custodiol» нет статистических различий в исследуемых показателях на этапах аноксии и реперфузии, что указывает на эффективность защиты миокарда. Это согласуется с данными исследования из НЦ ССХ РАМН им. А.Н. Бакулева, где констатировано отсутствие достоверных изменений показателей митохондриального индекса и запасов гликогена в период аноксии и реперфузии при кардиопротекции раствором «Custodiol» у детей первого года жизни [8]. В то же время обнаруженное нами наличие фрагментированной ДНК в цитоплазме клетки отражает повреждение ядерных мембран кардиоцитов и косвенно указывает на активизацию процессов свободно радикального окисления.

Немаловажен и факт, что в группу «Custodiol» вошли пациенты со сложными пороками, в том числе и с цианотическими, что требовало длительных сроков выключения сердца из кровообращения: окклюзия Ао 60±3,8 мин; ИК 112,1±5,4 мин. Клинические характеристики адекватности защиты миокарда у всех пациентов показали отсутствие ишемических изменений и локальных нарушений сократимости сердечной мышцы. Транзиторные нарушения A-V проводимости были кратковременны и гемодинамически незначимы. Экспериментальными работами нашего института методом лазерно-индуцированной флуоресценции доказано снижение устойчивости проводящих структур сердца к ишемии по сравнению с рабочими кардиомиоцитами [7]. У одного летального пациента на этапе аноксии и реперфузии зарегистрировано соотношение показателя, приближающееся 1:1 с одновременным снижением интенсивности флуоресценции, что ставит под сомнение адекватность кардиопротекции, в то же время клинику сердечной недостаточности необходимо соотносить со стадией порока (ЛГ) III ст. и кризовым течением послеоперационного периода.

ВЫВОДЫ

• 1.    Метод лазерно-индуцированной флуоресценции с оценкой степени повреждения ДНК карди-оцитов может быть использован в клинической практике как критерий адекватности кардиопротекции и вносит перспективы в дальнейшее изучение ультраструктурных сдвигов кардиоцитов с комплексным морфологическим анализом.

• 2.    При защите миокарда раствором «Custodiol» на этапах коррекции ВПС у детей первого года жизни определяется дефрагментация ДНК кардиоцитов с выходом фрагментов ДНК в цитоплазму.

• 3.    При защите миокарда раствором «Custodiol» не зарегистрировано достоверных различий в степени фрагментации ДНК на этапах аноксии и реперфузии по сравнению с доокклюзионным периодом, что указывает на эффективность кардиопротекции и относительную сохранность ультраструктуры миокарда.

• 4.    Отсутствие корреляционной зависимости процентного содержания фрагментированной ДНК в цитоплазме кардиоцитов с длительностью выключения сердца из кровообращения свидетельствует о надежности кардиопротекции раствором «Custodiol» при сроке выключения сердца из кровообращения до 60 мин.

• 5.    Клинические характеристики адекватности защиты миокарда соответствовали лабораторным данным - у всех пациентов в ближайшем послеоперационном периоде отсутствовали ишемические изменения и локальные нарушения сократимости сердечной мышцы. Нарушения A-V проводимости были транзиторны и гемодинамически незначимы.

• 6.    Нами, по-видимому, зарегистрирована сомнительная кардиопротекция у одного летального пациента, но в данном случае этот факт необходимо соотносить со стадией порока (ЛГ)

III ст. и кризовым течением послеоперационного периода.