Одновременная регистрация сокращения различных типов скелетных мышц in vivo

И зучение функционального состояния скелетной мускулатуры - основа комплексного исследования организма. Основным методом исследования является регистрация параметров проявления основной функции двигательной системы – сокращения мышц [1].

Известные классические методы регистрации контрактильных кривых предусматривают предварительную экстирпацию мышцы, либо ее части, а потом проведение эксперимента in vitro [2].

При этом, по принятому стандарту [3, 4], выделенные мышцы фиксируют вертикально, присоединяя один конец к датчику механической активности, в термостатируемых ванночках, заполненных физиологическим раствором. Раздражение мышц электрическим полем проводят стимулятором при помощи двух проводящих колец диаметром 2.5 мм, расположенных на расстоянии 15 мм друг от друга, через которые должна быть пропущена мышца.

Однако, экспериментальные данные, полученные на выделенной мышце не могут быть адекватно аппроксимированы на интактные, так как выделенный мышечный орган находится в неестественном состоянии.

МЕТОД

Нами разработан протокол одновременной регистрации сокращения двух и более мышц in vivo , что позволяет осуществлять эксперимент в максимально возможно нативных условиях. Единственным приближенным прототипом можно представить лишь одно известное по источникам устройство [5].

Наркотизация лабораторного животного проводится нами масляным раствором эфира внутрибрюшинно. Выбранная для проведения экспериментов конечность лабораторного животного освобождает от шерстяного покрова выбриванием или выщипыванием шерсти. С этого момента и до конца острого эксперимента выбранная конечность чуть прогревается от подведенной для освещения лампы накаливания. На дистальной части выбранной конечности (соответственно, голени или предплечье) проводится продольный разрез поверхностных тканей над выбранными для проведения эксперимента мышцами. Аккуратно отсепаровываются лежащие выше выбранных мышц мягкие ткани. Крупные сосуды при проведении всей вивисекции не должны повреждаться. При выступлении крови необходимо ее промаки-вать ватными тампонами.

Далее проводится выделение дистальных сухожилий выбранных мышц (например, ахиллово сухожилие). Удостоверяется правильность выбора сухожилия соответствием реакции частей конечности при адекватном потягивании его в проксимальном направлении (к примеру: потягивание дистального сухожилия m. extensor digitorum longus вызовет разгибание пальцев данной конечности). После чего под выбранные сухожилия подводится лигатура из нерастягивающейся нити. Затем дистальнее лигатуры сухожилие перерезается. Начиная со свободного дистального конца выбранные мышцы тщательно выделяются наполовину своей нативной длины.

Следующий этап работы начинается с продольного разреза покровных тканей проксимального отдела той же конечности (соответственно, бедра или плеча) по пролегающему ниже нервному стволу (к примеру: седалищного нерва). Отсе-паровывая мягкие ткани, выделяется участок соответствующего нерва без нарушения иннервации выбранных для эксперимента мышц. После чего выделенный участок нерва обхватывается изолированными от остальных тканей контактами погружного электрода.

Завершающим этапом подготовки лабораторного животного к эксперименту является катетеризация основной артерии данной конечности. Для этого производится разрез покровных тканей над местом пролегания основной артерии данной конечности (к примеру, бедренной). Без дополнительных повреждений отсепаровываются соответствующие фасции мышц, лежащих над выбранным участком нужной артерии. Раздвигаются мягкие ткани. Осуществляется катетеризация оперированной конечности детским катетером, совместимым с системой подачи жидкости.

Подготовленное таким образом лабораторное животное укладывается на неколеблющуюся подставку. Все четыре конечности закрепляются жестко бинтами за штыри подставки. Мышцы посредством лигатуры прикрепляются за перерезанные дистальные сухожилия к изометрическим датчикам.

В работе возможно применение 2 методов стимуляции мышц:

• 1.    Прямая стимуляция мышц с помощью игольчатых электродов.

• 2.    Непрямая стимуляция – раздражение нерва (к примеру, седалищного) посредством погружного электрода.

Кривые мышечных сокращений регистрируются, усредняются и обрабатываются с помощью специализированной компьютерной программы.

Одиночные сокращения мышц вызываются стимуляцией электрическим полем в течение 30 с прямоугольными импульсами частотой 1 Гц, длиной 0.5 мс, амплитудой порядка 10 В – для непрямой стимуляции и около 100 В – в случае прямой. Также, увеличивая частоту раздражения, можно регистрировать зубчатые и гладкие тетанические сокращения. Сила сокращений регистрируется изометрическими датчиками механической активности (к примеру: MLT050/D производства ID Instruments (Австралия)), аналоговый сигнал оцифровывается и обрабатывается стандартной системой сбора данных. Средняя сила всех сокращений, полученных в течение 30 с (30 ответов) представляется как один результат.

После 30-минутного покоя мышцы через седалищный нерв несколько раз стимулируются электрическим полем с интервалом 10 минут до дос- тижения стабильных сокращений. Все последующие сокращения оцениваются относительно этого начального ответа, принятого за 100%.

Через катетеризированную бедренную артерию вводятся агенты, чье действие на параметры мышечного сокращения исследуется.

Данная установка с предложенным способом проведения экспериментов позволяет одновременно исследовать действие фармакологических агентов на функциональное состояние различных по типу скелетных мышц: содержащих преобладающее количество «медленных» волокон (к примеру: m. soleus , m. plantaris и т.п.) и содержащих большее количество «быстрых» волокон (к примеру: m. extensor digitorum longus , m. gastrocnemius и т.п.).

Мы провели сравнительные серии экспериментов по регистрации кривых сокращения мышц голени крысы ( m. soleus и m. extensor digitorum longus ) in vivo , а потом, экстирпировав те же мышцы, in vitro . Оказалось, что амплитудные и временные параметры сокращения в обоих случаях, в целом, совпадают. Так, при регистрации in vivo мы получили следующие параметры сокращения m. soleus: сила сокращения составила 2.49±0.06 г, время сокращения 0.079±0.006 с и время полурасслабления 0.180±0.008 с (n=8).

В следующей серии мы допрепаровывали данные мышцы, полностью выделяя их из тела животных и помещали в перфузируемую раствором Кребса ванночку механомиографической установки. При условиях, соответствующих нативным (37 °С), усредненная кривая сокращения m. soleus имела следующие параметры: сила сокращения камбаловидной мышцы крысы составила 2.54 ± 0.06 г, время сокращения 0.075 ± 0.006 с и время полурасслабления 0.173 ± 0.007 с (n=8), что достоверно не отличалось (р>0.05) от значений, полученных нами in vivo .

Сходные результаты мы получили и в экспериментах с m. extensor digitorum longus in vivo и in vitro .

Из проведенных экспериментов следует признание адекватности применяемых методик с признанием более физиологичным проведение экспериментов in vivo .

Поддержано грантом РФФИ № 13-04-01345.