Одновременное определение содержания железа и меди в цельной крови сельскохозяйственных животных и птицы



В 6-6 - месячном возрасте, что соответствует периоду формирования половой функции, содержание тиреоидных гормонов оставалось ещё на относительно высоком уровне: Т₃ – 2,02±0,14 – 2,4±0,15 нмоль/л и Т₄ – 114,0±7,23 – 120,5±9,0 нмоль/л. У 7- месячных свинок содержание гормонов резко снижалось: Т₃ до уровня 1,65±0,23 нмоль/л, а Т 4 до 98,0±5,15 нмоль/л. В последующие возрастные периоды уровень тиреоидных гормонов в крови свинок также продолжал снижаться, достигая минимального значения в 10- месячном возрасте (Т 3 – 0,90±0,16; Т 4 – 68,0±7,0 нмоль/л).

Содержание кортизола в крови свинок имело противоположную динамику, по сравнению с тиреоидными гормонами. До полового созревания его уровень в крови животных был наименьшим и колебался в границах 53,5±4,03 – 54,0±4,88 нмоль/л. В период становления половой функции содержание кортизола значительно повысилось и достигало у 5- месячных животных 68,8±5,61 нмоль/л, и у 6- месячных – 98,7±6,97 нмоль/л. В дальнейшем концентрация кортизола в крови свинок продолжала постепенно повышаться вплоть до окончания эксперимента, достигая в 10- месячном возрасте 132,0±7,07 нмоль/л.

Результаты исследований

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что становление половой функции у самок животных характеризуется каскадом функциональных и поведенческих процессов. При этом некоторые биологические изменения протекают в этой фазе развития животного дискретно и могут быть оценены количественно, другие – менее очевидны и их оценка более сложна. Тем не менее, можно с уверенностью констатировать, что становление половой функции у самок - это весьма сложный процесс, в основе которого лежит перестройка функционирования гипоталамо-гипофизарно-овариального комплекса, обеспечивающая формирование качественно новых отношений между отдельными его звеньями.

Результаты исследований гормональной активности гипофиза, эпифиза, надпочечников, яичников и щитовидной железы существенно дополняют представления об интерьерных перестройках, происходящих в репродуктивной системе самок в период становления половой функции. Установленные взаимосвязи между функциональным состоянием желез внутренней секреции носят сложный характер, что необходимо учитывать при разработке новых средств и методов регуляции воспроизводительной функции у свиней.

Литература

• 1.    Сеин О.Б. Способ подготовки хряка-пробника / О.Б. Сеин, Н.А. Бабанин// Ветеринария. – 1990. - №7.- с. 50-51.

• 2.    Хантер Р. Физиология и технология воспроизводства домашних животных / Р. Хантер// - М.: Колос, 1984.- 319 с.

• 3.    Evans F. Development of the circadian rhythm of cortisol in the gilt from weaning until puberty / Evans F., R. Christopherson, F. Aherne //Canad. J. Anim. Sc., - 1988. – V.68. - №4. – P. 1105-1111.

• 4.    Li P. Catercholamine inhibition of luteinizing hormone secretion in isolated pig pituitary cells / P. Li // Biol. Reprod. – 1989. – V.40. - №5. – Р. 914-919.

УДК 636.22 / 28

ОДНОВРЕМ ЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖ АНИЯ Ж ЕЛЕЗА И МЕДИ В ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫ Х Ж ИВОТНЫ Х И ПТИЦЫ

А.К. Джавадов , д.б.н., ФГОУ ВПО Орел ГАУ

• В. А. Мещерякова , ФГОУВПО Орел ГАУ

Ж елезо и медь являются важными элементами для организма животных и человека. Ж елезо входит в состав гемоглобина, миоглобина и некоторых клеточных ферментов (каталазы, пероксидазы и цитохромы). Медь принимает непосредственное участие в гемопоэзе, катализирует включение железа в структуру гемма, способствует созреванию эритроцитов. [1,2].

При недостатке железа и меди в организме развивается анемия, сопровождаемая снижением в крови гемоглобина, железа и меди. Поэтому для диагностики различных форм анемии необходимо определение содержания их в периферической крови.

Учитывая сложности известных способов [3,4] определения железа и меди в крови животных, нами была разработана методика одновременного определения этих элементов.

Целью наших исследований было изучение возможности уменьшения количества крови, необходимой для проведения анализа, упрощение процедуры подготовки проб, повышение точности р езультатов, а также разработка метода определения содержания железа и меди в цельной крови с использованием 40 мг% раствора железа сернокислого закисного 7-водного и 100 мкг/%-ного раствора сернокислой меди минуя процесс построения калибровочных кривых.

Принцип : Медь дифинилкарбазоном, а железо с о-фенантролином при определенном рН образуют соединения, придающие растворам определенную окраску, интенсивность которой измеряют на фотоэлетрокалориметре.

Реактивы: смесь концентрированной азотной (HNO3) и хлорной (HClO4) кислот в соотношении 3:1; 1 н. раствор соляной кислоты (HCl) (82 мл концентрированной HCl доводят в мерной колбе объемом 1 л бидистиллированной водой до метки), для определения железа: 2 н. раствор HCl (164 мл концентрированной HCl доводят в мерной колбе объемом 1 л бидистиллированной водой до метки);

• 10 % раствор аммиака (40 мл 25 % раствора аммиака доводят в мерной колбе на 100 мл биди-стиллированной водой до м етки);

• 0,1 % водный р аствор паранитрофенола;

• 1    % раствор аскорбиновой кислоты (хранится около 2 нед в холодильнике в темной склянке);

• 1 % раствор солянокислого о -фенантролина (1 г о -фенантролина смачивают 1 мл концентрированной HCl и доводят бидистиллированной водой до 100 мл, хранится около 2 нед в холодильнике в темной склянке);

основной стандартный р аствор железа — 40 мг% (196 мг железа сернокислого закисного 7-водного (х.ч.), содержащего 20,4 % железа, растворяют в 100 мл 2 н. раствора HCl, хранится до 2 нед. в холодильнике;

рабочий стандартный раствор железа (10 мл основного раствора железа доводят в мерной колбе на 100 мл бидистиллированной водой до метки, готовится в день исследования);

для определения меди : 10 % раствор аммиака (40 мл 25 % раствора аммиака доводят в мерной колбе на 100 мл бидистиллированной водой до метки);

• 0,1 ммоль/л ацетатный буфер, pH 4. В мерной колбе на 1 л р астворяют 13,608 г натр ия ацетата (CH 3 COONa 3H 2 O, х.ч.), приливают 25 мл ледяной уксусной кислоты (х.ч.) и доводят объём дистиллированной водой до метки. Далее буфер фильтруют и определяют pH. Хр анят в тёмной склянке 2 недели;

• 0,01% р аствор дифинилкорбазона в бензоле. 10 мг реактива вносят в мерную колбу на 100 мл, до бавляют 40-50 мл бензола (х.ч.) и нагревают в стакане с горячей водой до растворения реактива. Колбу охлаждают и доводят объём бензолом до метки. Раствор хранят в тёмной склянке 2 недели;

• 0,1% - ный спиртовой раствор фенолфталеина;

• 2 н. р аствор соляной кислоты;

основной стандартный р аствор меди (100 мкг/мл) 0,3928 свежеперекристаллизованной меди суль фата (CuSO4 . 5H2O) растворяют в 1 л 2 н. раствором соляной кислоты;

рабочий стандартный раствор меди (1 мл основного стандартного раствора меди доводят бидистиллированой водой в мерной колбе на 100 мл до м етки)

Описание методики . В огнеупорную пробирку вносят 0,6 мл цельной крови, высушивают и сжигают на песочной бане в течение 10 мин. Добавляют 1 мл смеси HNO 3 и HClO 4 в соотношении 3:1 и сжигают (не допуская разбрызгивания раствора в начале) 6-8 ч при температуре 180-190 ^оС до полного просветления раствора. Затем содержимое пробирки высушивают досуха. После этого золу растворяют в 3 мл 2 н. раствора HCl.

Определение ж елеза . Для определения железа в химическую пробирку вносят 0,5 мл раствора золы прибавляют 0,5 мл бидистиллированной воды и перемешивают.

В пробирку с меткой на 5 мл вносят 0,2 мл приготовленного раствора золы, 0,5 мл 2 н. раствора HCl и 1,5 мл бидистиллированной воды. Затем добавляют 1 каплю 0,1 % паранитрофенола и нейтрализуют (титруют по каплям) 10 % раствором аммиака до появления желтой окраски. Далее содержимое пробирки титруют 1 н. раствором HCl до исчезновения окраски. После титрования добавляют 5 капель 1 % раствора аскорбиновой кислоты, перемешивают и через 10 мин до бавляют 0,2 мл 1 % раствора солянокислого о -фенантролина. Объем доводят до м етки бидистиллированной водой и через 30 мин. измеряют интенсивность окраски на ФЭК при 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной 1 см против контроля.

Одновременно готовят контрольные и стандартные пробы.

Контроль . В три мерные пробирки вносят 0,7 мл 2 н. раствора HCl, по 1,5 мл бидистиллиро-ванной воды и затем 1 каплю 0,1 % раствора па ра -нитрофенола и далее проводят вышеописанную процедуру.

Стандарт . Стандартные пробы (три) готовят так же, как и опытные, но вместо раствора золы берут 0,2 мл рабочего стандартного раствора железа.

Расчет проводят по формуле Х = А / К x 40 , где X — содержание железа, мг%; А — интенсивность окраски пробы; К — интенсивность окраски стандарта; 40 — коэффициент для пересчета в мг%.

Определение меди . В пробирки, где остались 2,5 мл раствора золы добавляют 2,5 мл биди-стиллированной воды. Затем перемешивают прибавляют 1 каплю 0,1%-ного раствора фенолфталеина и титруют 10%-ным раствором аммиака до появления светло-розовой окраски. В случае пе-ретитрования добавляют несколько капель 2 н. раствора НСI до получения нужной окраски. Далее для установления рН в пробирку прибавляют 1 мл ацетатного буфера. При этом розовая окраска исчезает. Затем в пробирку вносят 5 мл 0,01%-ного раствора дифинилкарбазона и встряхивают в течение 1 минуты. После расслоения раствор дифинилкарбазона (верхний слой) при-о бретает красную окраску. Интенсивность окраски верхнего слоя измеряют на ФЭК при 540 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной 1 см против контроля.

Одновременно готовят контрольные и стандартные пробы

Контроль . В три химические пробирки вносят по 2,5 мл 2 н. раствора HCl, и 2,5 мл бидистил-лированной воды. После перемешивания добавляют 1 каплю 0,1%-ного раствора фенолфталеина и далее проводят вышеописанную процедуру.

Стандарт . В химические пробирки (три) вносят по 0,5 мл рабочего раствора сернокислой меди, 2,0 мл 2 н. раствора HCl, и 2,5 мл биди-стиллированной воды. Перемешивают и добавляют 1 каплю 0,1%-ного раствора фенолфталеина, а затем обрабатывают как опытные пробы.

Расчет проводят по формуле Х = А / К x 100 , где X — содержание меди, мкг%; А — интенсивность окраски пробы; К — интенсивность окраски стандарта; 100 — коэффициент для пересчета в мкг%.

Таким образом, определение содержания железа и меди в крови животных по предлагаемому способу дает возможность уменьшить объем проб крови, необходимой для проведения анализа, в 3,2 раза, а использование мокрого озоления для предварительной подготовки проб к анализу — упростить процесс и уменьшить расход электроэнергии. При добавлении 1 % раствора солянокислого о -фенантролина (от количества которого зависит интенсивность окраски и результаты проводимых исследований) не по каплям (5 капель), а по 0,2 мл повышается точность проводимых анализов. Использование 40 мг% рабочего раствора железа сернокислого закисного 7-водного и 100 мкг% раствора сернокислой меди в качестве стандарта позволяет определить содержание железа и меди в крови животных, минуя процесс построения калибровочных графиков.