Окислительная модификация белков сердечной и скелетной мускулатуры крыс под влиянием субстрата синтеза оксида азота

тельных повреждений, что связано с достаточно активным образованием карбонильных производных и их стабильностью [Дубинина, Пустыгина, 2008; Абаленихина, Фомина, Исаков, 2013].

Окислительная модификация белков (ОМБ) является одним из наиболее ранних проявлений поражения тканей при свободно-радикальной патологии [Губский и др., 2005]. Процесс старения заметно увеличивает рост чувствительности белков к окислению, в результате чего происходит накопление в тканях их окисленных форм. Достоверно известно, что количество окисляющихся белков в клетке обусловлено генетически и является ее постоянной фенотипической характеристикой [Еременко, Малоштан, 2014].

Накопление окисленных протеинов трактуется в качестве фактора регуляции синтеза и распада белков и активации протеолитических ферментов, которые избирательно разрушают окисленные формы. Этот механизм является проявлением антиоксидантной защиты организма, поэтому оценка степени ОМБ может считаться одним из наиболее надежных индикаторов свободно-радикального повреждения тканей, клеток и мембран [Еременко, Малоштан, 2014].

Материалы и методы исследований

Работа была выполнена на 24 конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 280-320 г, разделенных на две группы: контрольную и экспериментальную. Содержание лабораторных животных и выведение из эксперимента осуществлялось согласно «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 06.04.1993; и в соответствии с правилами, изложенными Международным Советом Медицинских Научных Обществ (CIOMS) в «Международных рекомендациях по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1985 г.) и приказе МЗРФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Животным экспериментальной группы внутри-желудочно вводился раствор L-аргинина («Sigma». США) на 0.9%-ном растворе NaCl в дозе 500 мг/кг [Покровский и др., 2008]. Препарат вводили 1 раз в сутки до утреннего кормления ежедневно в течение 10 дней.

Контрольная группа была сформирована из животных, сопоставимых по возрасту, массе и условиям содержания с экспериментальными особями. Животным контрольной группы вводили физиологический раствор по схеме, совпадающей с таковой для экспериментальной группы.

После обескровливания под эфирным рауш-наркозом при сохраненном дыхании и сердцебиении осуществляли извлечение сердца и скелетной мышцы передней поверхности бедра с помещением тканей в охлажденный 0.25 М раствор сахарозы. Гомогенизация участков ткани левого желудочка сердца и скелетной мышцы передней поверхности бедра осуществлялась с помощью аппарата «Potter S» (Sartorius, Германия) в охлаждённом 0.25 М растворе сахарозы в соотношении 1/10 в течение 60 сек. при скорости вращения тефлонового пестика 1500 об/мин.

Полученные гомогенаты подвергали дифференциальному центрифугированию для получения чистой цитоплазматической (неседиментируемой) фракции, в которой оценивали содержание ОМБ по методу R.L. Levine в модификации [Дубинина и др., 1995], после предварительного осаждения нуклеиновых кислот 10%-ным раствором стрептомицина сульфата.

По полученным результатам строили спектр поглощения продуктов ОМБ и подсчитывали площадь под полученной кривой [Пат., 2014]; значения выражались в условных единицах на грамм белка (у.е./г белка).

Оценка резервно-адаптационного потенциала (РАЛ) производилась путем подсчета отношения общей площади под кривой карбонильных производных белков при спонтанном окислении протеинов к индуцированному по реакции Фентона, принимая общее количество динитрофенилгидразонов за 100% [Никитина, Мухина, 2009].

Статистическая обработка анализа результатов исследования проведена согласно руководствам по медицинской статистике с использованием программы «Microsoft Office Excel 2010» и «Statistica 10.0». Проверку нормальности распределения данных осуществляли с помощью критерия Шапиро-Уилка (W-критерий). Поскольку отмечалось отсутствие согласия большинства данных с нормальным распределением, вычисляли характеристики: медиану, минимальное и максимальное значения, результаты представляли в формате Me [min; max], для оценки статистической значимости различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест).

Результаты и их обсуждение

В скелетной мышце под влиянием аргинина в дозе 500 мг/кг в экспериментальной группе животных наблюдается незначительное снижение содержания карбонильных производных нейтрального характера по сравнению с контрольными значениями (табл. 1, рис. 1). Статистически значимо уменьшается содержание альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) нейтрального характера в ультрафиолетовой части спектра. Снижение суммарного содержания карбонильных производных белков (статистически значимое) в экспериментальной группе по отношению к контрольным показателям может свидетельствовать о запуске механизмов вторичной антиоксидантной защиты в тканях [Ду- тканях [Дубинина, Пустыгина, 2008; Абаленихина, дификации белков в ткани скелетной мышцы пе-Фомина, 2014], с подавлением окислительной мо- редней поверхности бедра.

Таблица 1

Площадь под кривой спонтанной окислительной модификации белков (у.е./г белка); Me [min; max]

Показатель		SАДНФГт	S АД НФ Tvs	SКДНФГт	S КДНФГ\5	БОМБ
Скелетная мышца	Контроль	23.17 [22.34; 24.78]	6.30 [5.78; 6.81]	4.26 [4.26; 6.31]	1.06 [1.05; 1.28]	35.01 [33.43; 38.96]
	Эксперимент	17.36 [14.24; 20.21] *	4.04 [2.71; 6.31]	4.50 [2.69; 5.85]	0.88 [0.34; 1.34]	27.08 [21.80; 33.15] *
Сердечная мышца	Контроль	21.28 [19.58; 22.80]	3.25 [2.28; 5.21]	3.28 [0.99; 4.77]	0.44 [0.42; 0.71]	28.23 [23.79; 32.99]
	Эксперимент	18.97 [18.30; 19.10] *	6.23 [5.41; 8.02] *	5.24 [4.79; 7.79] *	0.89 [0.83; 1.27] *	31.33 [29.64; 36.17]

*- статистически значимые отличия от группы контроля (р<0.05).

* контроль fl Аргинин

Рис. 1. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов спонтанной окислительной модификации белков и их компонентов в скелетной мышце контрольной и экспериментальной групп животных (у.е./г белка)

Изменения, касающиеся левого желудочка сердца крысы, характеризуются снижением АДНФГ нейтрального характера; нарастанием АДНФГ основного характера и обеих групп кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ), результаты статистически значимо отличаются от контрольной группы крыс (табл. 1, рис. 2).

Рис. 2. Сравнительный анализ спектра поглощения продуктов спонтанной окислительной модификации белков и их компонентов в миокарде контрольной и экспериментальной групп животных (у.е./г белка)

В результате последних исследований принято альдегидные производные считать ранними маркерами ОМБ, характеризующими процесс фрагментации, а кетонные - поздними, отражающими агрегацию белков, результатом которой может оказаться нарушение их нативной конформации [Губский и др., 2005].

Образование альдегидов происходит в условиях стимуляции свободно-радикальных превращений в клетках, которые имеют место при оксидативном стрессе [Давыдов, Божков, 2014]. Ввиду уже доказанной причинно-следственной связи между карбонильным и оксидативным стрессом [Давыдов, Божков, 2014], можно предположить, что в результате воздействия субстрата синтеза оксида азота на сердце и скелетную мышцу крыс происходит статистически значимый рост показателей ранних маркеров карбонильного стресса относительно контрольной группы животных (табл. 2, рис. 3), вследствие активации образования альдегидов.

Контроль. Контроль.

15%

13%

85%                 87%

Скелетная мышца.

Сердечная мышца.

19%                  20%

доля АДНФГ (первичные маркеры) ■ доля КДНФГ (вторичные маркеры)

Рис. 3. Доля первичных и вторичных маркеров относительно общего содержания карбонильных производных белков

В изучаемых образцах мускулатуры крыс наблюдается уменьшение доли вторичных маркеров (КДНФГ), что может свидетельствовать о сниже- нии степени ОМБ или о повышении скорости утилизации измененного белка (вторичный антиоксидантный эффект) [Владимирский. Бородина. Аба шева. 2013]. Статистически значимое отличие от группы контроля наблюдается в ткани сердца крыс под влиянием аргинина.

Таблица 2

Суммарное содержание первичных и вторичных маркеров окислительного стресса экспериментальной и контрольной групп животных (у.е./г белка); Me [min; max]

Показатель/ группа		S АДНФГиу + S АДНФГта	S КДНФГ„ + S КДНФГ,,
Скелетная мышца	Контроль	29.48 [28.12; 31.59]	5.33 [5.31; 7.37]
	Эксперимент	21.39 [17.46; 26.06] *	5.38 [3.26; 7.09]
Сердечная мышца	Контроль	24.53 [22.38; 27.50]	3.72 [1.42; 5.48]
	Эксперимент	25.21 [24.02; 27.11]	6.13 [5.62; 9.06] *

*- статистически значимые отличия от группы контроля (р<0.05).

Оценка содержания динитрофенилгидразонов при спонтанном окислении белков позволяет охарактеризовать степень окислительной деструкции белковой молекулы, а при стимулированном (ме-талл-катализируемом) окислении - описать изменения резервно-адаптационных возможностей организма [Владимирский. Бородина. Абашева. 2013]. Металл-катализируемое окисление в настоящее время рассматривают как посттранскрипционную окислительную модификацию белков [Дубинина. 2006].

Исходя из данных литературы [Давыдов. Божков. 2014]. можно сделать следующее предположение: аргинин, являясь донатором синтеза оксида азота. увеличивает степень окислительно-го/карбонильного стресса [Капелько и др.. 2008; Давыдов. Божков. 2014]. тем самым уменьшая степень РАП относительно групп контроля (рис. 4. 5).

Рис. 4. Оценка резервно-адаптационного потенциала ткани скелетной мышцы аргинин/контроль

Однако в группе воздействия на сердечную мышцу аргинином (рис. 4). РАП S АДНФГ,,, незначительно статистически значимо увеличился по сравнению с контролем. Возможно, причиной та ковых изменений является дефицит нитроксида. при котором динитрозильные комплексы негемового железа (ДНКЖ). содержащие цистеин или глутатион [Шумаев. Космачевская. Топунов, 2008]. распадаются, освобождая NO из собственных депо [Капелько и др., 2008; Абаленихина. Фомина. 2014].

■ ДНФГ -РАП

Рис. 5. Оценка резервно-адаптационного потенциала ткани сердечной мышцы аргинин/контроль

* - статистически значимые отличия от группы контроля (р<0.05)

Динитрозильные комплексы негемового железа обнаружены во многих клетках и тканях, продуцирующих оксид азота. ДНКЖ являются стабильными депо NO. в свою очередь, низкомолекулярные ДНКЖ выполняют функцию его переносчика [Граник. Григорьев. 2004]. Таким образом, динитрозильные комплексы негемового железа могут образовываться в клетках при умеренном окислительном стрессе и тем самым формировать собственный внутриклеточный пул NO как форму запасания оксида азота. Вместе с тем при снижении уровня NO окислительный стресс активирует его выход из комплексов с последующим демпфиро- ванием повреждающего действия активных форм кислорода [Капелько и др., 2008].

Заключение

Таким образом, результаты исследования демонстрируют, что применение аргинина в дозе 500 мг/кг у экспериментальных крыс вызывает снижение окислительной модификации белков в скелетной мышце за счет уменьшения образования аль-дегид-динитрофенилгидразонов, как первичных маркеров оксидативного стресса без существенных изменений резервно-адаптационного потенциала. Миокард в тех же условиях демонстрирует тенденцию к нарастанию карбонильных производных белков, в большей степени кетон-динитрофенилгидразонов, и истощению резервноадаптационного потенциала.