Окислительная модификация белков в эритроцитах и плазме крови в динамике экспериментального рака яичников

Введение.^* Рак яичников (РЯ) относят к агрессивным опухолям человека, склонным к рецидивированию и, как следствие, имеющим низкие показатели выживаемости больных [6, 8].

Сложность проведения экспериментов на человеке делает актуальными вопросы моделирования злокачественных опухолей на экспериментальных животных. В случае РЯ используется модель перевиваемой асцитной опухоли.

Возникновение и развитие патологических процессов в организме сопровождается избыточным образованием активных форм кислорода (АФК) в организме, приводящих к усилению процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и окислительной модификации белков (ОМБ) [2, 13].

В отличие от продуктов пероксидации липидов, карбонильные производные белков эритроцитов гораздо более стабильны, способны улавливать от 50 до 75 % свободных радикалов и могут являться маркерами окислительного повреждения в тканях [2, 14]. Экспериментальные исследования показывают, что в первую очередь окислительной деградации подвергаются молекулы белков мембран. При окислении белков в них образуются альдегидные и кетоновые группы аминокислотных остатков (карбонильные группы) [1, 4, 9, 11].

Цель исследования. Оценка карбонильных групп белков в эритроцитах и в плазме крови в динамике экспериментального рака яичников.

Материалы и методы. Экспериментальные исследования проведены на белых беспородных крысах массой 180–200 г с перевиваемой асцитной опухолью (штамм опухоли яичников (ОЯ) был получен из банка штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН). После предварительного пассажа на 8-й день после внутрибрюшинной перевивки от одной крысы был взят асцит и перевит животным экспериментальной группы (7∙107 опухолевых клеток в каждой дозе). Прогрессирование данного типа опухоли проходит в 3 фазы: логарифмическая (с 4-х сут после перевивки), стационарная (с 8-х сут после перевивки), терминальная (с 13-х сут после перевивки). Материалом для исследований послужили эритроциты и плазма крови животных в стационарную (n=22) и терминальную (n=22) фазы роста опухоли. Контрольную группу составили здоровые самки (n=24). Оценивали уровень ОМБ по методу Е.Е. Дубининой [2]. Результаты учитывали на спектрофотометре Genesys (Thermo Scientific, USA). При λ=346 нм оценивали альдегидные группы нейтрального характера; при λ=370 нм – ке-тонные группы нейтрального характера; при λ=430 нм – альдегидные группы основного характера и при λ=530 нм – кетонные группы основного характера. Данные в гемолизате эритроцитов пересчитывали на грамм гемоглобина (Hb), определенный стандартным гемиглобинцианидным методом (набор «АГАТ», г. Москва), в плазме крови – на 1 мг белка по методу Брэдфорда [7]. Статистиче- ская обработка материала осуществлялась с помощью программ Microsoft Excel 2010. Достоверность различий средних показателей вычисляли с использованием критерия Стьюдента. Статистические гипотезы считали подтвержденными при уровне значимости р<0,05.

Результаты и обсуждение. ОМБ играет важную роль в обмене белков в организме. Накопление окисленных белков рассматривается как один из факторов регуляции синтеза и распада белков, активации мультикатали-тических протеаз, избирательно разрушающих окисленные белки [10, 12]. Карбонильные производные белков плазмы и эритроцитов более стабильны и специфичны, что позволяет использовать их в качестве маркеров оксидативного стресса при патологических процессах [2].

Полученные нами данные свидетельствуют о выраженном повышении уровня карбонильных производных нейтрального и основного характера в эритроцитах (рис. 1) и в плазме крови (рис. 2) как в стационарную фазу роста асцитной опухоли яичников (АОЯ), так и в терминальную.

Рис. 1. Содержание продуктов ОМБ в эритроцитах в динамике экспериментального рака яичников (* р≤ 0,05 – данные, статистически значимо отличающиеся от контроля)

Из данных, представленных на рис. 1, следует, что содержание альдегидных групп нейтрального характера в гемолизате эритроцитов (λ=346 нм) статистически значимо увеличивается относительно контроля и составляет в стационарную фазу роста опухоли

0,066±0,004 ед. опт. пл./г Hb; в терминальную – 0,073±0,006 ед. опт. пл./г Hb (в контроле – 0,039±0,003 ед. опт. пл./г Hb (p 1 =0,002, p 2 =0,009)). Такая же динамика сохраняется и для кетонных групп нейтрального характера (λ=370 нм): в стационарную фазу роста

АОЯ уровень этих продуктов составил 0,082±0,005 ед. опт. пл./г Hb; в терминальную – 0,087±0,006 ед. опт. пл./г Hb против 0,050±0,003 ед. опт. пл./г Hb в контроле (p1=0,001, p2=0,009). При этом содержание продуктов ОМБ при λ=430 нм и λ=530 нм также было достоверно выше контрольных значений: при λ=430 нм в стационарную фазу – 0,044±0,003 ед. опт. пл./г Hb; в терминальную фазу – 0,046±0,005 ед. опт. пл./г Hb против 0,027±0,003 ед. опт. пл./г Hb в кон- троле (p1=0,001, p2=0,003). При λ=530 нм в стационарную и терминальную фазы уровень ОМБ составил 0,015±0,001 и 0,016±0,002 ед. опт. пл./г Hb соответственно против 0,009± ±0,001 ед. опт. пл./г Hb в контроле (p1=0,001, p2=0,001).

Таким образом, интенсивность ОМБ в динамике роста АОЯ в эритроцитах возрастает, что снижает дыхательную функцию крови, приводит к гипоксическим изменениям и усугубляет течение опухолевого процесса.

Рис. 2. Содержание продуктов ОМБ в плазме крови в динамике экспериментального РЯ (* р≤ 0,05 – данные, статистически значимо отличающиеся от контроля)

Проведенный нами сравнительный анализ окисления белков в плазме крови (рис. 2) для альдегидных групп показал, что при λ=346 нм в стационарную и терминальную фазы отмечается статистически значимое увеличение продуктов относительно контроля: 0,120±0,016 и 0,118±0,015 ед. опт. пл/мг белка соответственно против 0,103±0,006 ед. опт. пл./мг белка в контроле (p1=0,03, p2=0,02). Уровень кетонных групп нейтрального характера (λ=370 нм) в стационарную фазу роста АОЯ составил 0,107±0,014 ед. опт. пл./мг белка; в терминальную – 0,106±0,010 ед. опт. пл./мг белка; в контроле – 0,093±0,005 ед. опт. пл./мг белка (p1=0,01, p2=0,01). Установлено, что уровень карбонильных производных при λ=430 нм и λ=530 нм в стационарную и терминальную фазы также был достоверно выше контрольных значений: 0,065±0,007 и 0,067±0,001 ед. опт. пл./мг белка соответст- венно против 0,093±0,005 ед. опт. пл./мг белка в контроле (p1=0,007, p2=0,01). При λ=530 нм: 0,037±0,004 и 0,062±0,006 ед. опт. пл./мг белка соответственно против 0,027±0,002 ед. опт. пл./мг белка в контроле (p1=0,002, p2=0,005). Из данных рис. 2. следует, что содержание продуктов карбонильных производных белков в плазме крови у животных с РЯ возрастает по мере прогрессирования опухоли.

Таким образом, в динамике роста асцитной опухоли яичников в эритроцитах и в плазме крови отмечается повышенное образование карбонильных производных белков нейтрального и основного характера.

Заключение . При развитии экспериментального РЯ в плазме крови и эритроцитах возрастает количество продуктов ОМБ, что позволяет предполагать развитие карбонильного стресса.

• 1.    Булгакова Е. Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты / Е. Б. Булгакова // Успехи химии. – 2006. – № 9. – С. 105–110.

• 2.    Дубинина Е. Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток / Е. Е. Дубинина. – СПб. : Медицинская пресса, 2006. – 400 с.

• 3.    Изменение содержания продуктов окислительной модификации белков и липидов в опухолевой ткани на разных стадиях рака легкого / Р. Н. Белоногов [и др.] // Бюл. экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 147, № 5. – С. 562–564.

• 4.    Имянитов E. H. Молекулярная патология рака легкого: клинические аспекты / Е. Н. Имяни-тов // Практическая онкология. – 2006. – Т. 7, № 3. – С. 131–136.

• 5.    Применение наночастиц железа в термохимиотерапии экспериментальных опухолей / И. А. Горошинская [и др.] // Онкохирургия. – 2013. – № 1. – С. 84.

• 6.    Урманчеева А. Ф. Лекарственная терапия рецидивирующего рака яичника (обзор литературы) / А. Ф. Урманчеева // Сибирский онкологический журн. – 2010. – № 3 (39). – С. 28–33.

• 7.    Bradford M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities

  of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. – 1976. – Vol. 72. – P. 248–254.

• 8.    Cancer statistics, 2001 / R. T. Greenlee [et al.] // CA Cancer J. Clin. – 2001. – Vol. 1. – Р. 15–36.

• 9.    Dean R. T. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation / R. T. Dean, F. Stocker, M. Davies // Biochem. J. – 1997. – Vol. 324. – P. 1–18.

• 10.    Gieche J. Oxidation and protcolysis in RAW264.7 macrophages: effects of PMA activation / J. Gieche, J. Mehlhase, A. Liclu // Biochim. Biophys. Acta. – 2001. – Vol. 1538, № 2–3. – P. 321–328.

• 11.    Giulivi C. Tyrosine oxidation products: analysis and biological relevance / C. Giulivi, N. J. Tra-aseth, K. J. A. Davies // Amino acids. – 2003. – Vol. 25. – P. 227–232.

• 12.    Grune Т. Degradation of oxidized proteins in mammalian cells / Т. Grune, T. Reinheckel, K. Davies // FASEB J. – 1997. – Vol. 11, № 7. – P. 526–534.

• 13.    Kinnula V. L. Superoxide dismutases in malignant cells and human tumors / V. L. Kinnula, J. D. Crapo // Free Radic. Biol. Med. – 2004. – Vol. 36, № 6. – Р. 718–744.

• 14.    Stadtman E. R. Protein oxidation / E. R. Sta-dtman, R. L. Levine // Annals of N.Y. Academy of Sciences. – 2000. – Vol. 899. – P. 191–208.

OXIDATIVE MODIFICATION OF PROTEINS IN THE ERYTHROCYTES AND PLASMA IN THE DYNAMICS OF EXPERIMENTAL OVARIAN CANCER

A.Yu. Tuzeeva, Т.P. Gening, D.R. Dolgova

Ulyanovsk State University