Оксидативный стресс и антиоксидантная способность у недоношенных новорожденных с перинатальной гипоксией при рождении и на седьмые сутки жизни

Перинатальное гипоксически-ишемическое повреждение — важная причина заболеваемости новорожденных. Ранее показана продукция свободных радикалов и оксидативное повреждение при гипоксии плода [9]. Хотя клинические последствия гипоксии хорошо изучены, специфические биохимические процессы свободно-радикального повреждения неясны. Оксида-тивный стресс и повреждение тканей наблюдается при гиперпродукции свободных радикалов и/или дефиците антиоксидантов [7]. У новорожденных повышен риск оксидативного стресса, и они очень чувствительны к оксидативному повреждению [11] из-за дисбаланса между анти- и прооксидантами [8]. У новорожденных с гипоксией повышенная генерация свободных радикалов и окисление липидов в плазме отмечается сразу после рождения [5]. Терапия новорожденных в первую неделю после рождения (оксигенотерапия, искусственная вентиляция легких, парентеральное питание) усугубляет оксидативный стресс.

Свободные радикалы нейтрализуются антиоксидантами, включая внутриклеточные и внеклеточные антиоксидантные энзимы (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза) и низкомолекулярные антиоксиданты (глутатион, витамины C и E, каротиноиды), а также альбумин и метаболиты (мочевая кислота, билирубин).

Мы оценили динамику оксидативного повреждения и уровня антиоксидантов в первую неделю жизни новорожденных с перинатальной гипоксией.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В настоящее исследование были включены 79 новорожденных с гестационным возрастом 22–42 недели (табл. 1), родившихся в МУЗ «Родильный дом» № 2 г. Барнаула. Все новорожденные с дефектами развития, врожденными нарушениями метаболизма, резус-конфликтом, сепсисом, родившиеся от матерей с многоплодной беременностью и матерей с сахарным диабетом были исключены из исследования.

У 49 из 79 новорожденных диагностировалась перинатальная гипоксия по наличию по меньшей мере двух из следующих симптомов: интранаталь-ный дистресс с фетальной брадикардией < 100 ударов в минуту; < 6 баллов по шкале Апгар на 5-й мин; потребность в реанимационных мероприятиях > 1 мин с потребностью в кислородотерапии. Основанием для выбора этих критериев послужили работы G. Buonoсore [4–6], где показано, что указанные критерии оптимальны для диагностики перинатальной гипоксии даже легкой степени тяжести.

Гепаринизированные образцы крови забирались из умбиликальной вены после ее перерезания сразу после рождения и из периферической вены на 7-е сутки после рождения.

Тиобарбитурат-реактивные продукты (ТБРП) определялись фотометрически по интенсивности окраски комплекса с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [2]. В опытную пробирку вносилось 0,5 мл воды, 0,5 мл плазмы крови, 1,0 мл трихлоруксусной кислоты, 0,1 мл HCl и 1,0 мл ТБК. В контрольную вместо плазмы добавлялась вода. После инкубации при 100є C в течение 15 мин пробы охлаждались, центрифуги-

Таблица 1

	Гипоксия (n = 49)	Здоровые (n = 30)
Гестационный возраст (нед.)	36,0 ± 5,1	39,0 ± 1,2
Пол мужской/женский (n)	26/23	15/15
Вес при рождении (кг)	2,53 ± 0,69	3,34 ± 0,37
Баллы Апгар на 1-й мин	6,2 ± 1,2	7,1 ± 1,0
Баллы Апгар на 5-й мин	8,0 ± 1,1	9,7 ± 1,0
Интубация (n)	22	-
Вагинальные роды/кесарево сечение (n)	25/24	26/4

*Диагностические критерии перинатальной гипоксии — наличие по меньшей мере двух из следующих симптомов: интранатальный дистресс с фетальной брадикардией <  100 ударов в минуту; <  6 баллов по шкале Апгар на 5-й мин;

потребность в реанимационных мероприятиях > 1 мин с подачей кислорода.

Клиническая характеристика новорожденных*

ровались, и измерялась оптическая плотность против контрольной пробы при 535 нм.

Общая антиоксидантная активность (ОАА) плазмы определялась по степени ингибирования Fe2+/аскорбат-индуцированного окисления ТВИН-80 плазмой [1]. При этом в посуду темного стекла с притертыми пробками объемом 200 мл вносилось 2 мл ТВИН-80, 0,2 мл раствора сульфата железа, 0,2 мл раствора аскорбиновой кислоты и 0,1 мл плазмы крови. В контрольную пробу добавлялось 0,1 мл воды. После 48 ч инкубации при 40є С к 2,0 мл смеси добавлялся 1 мл ТХУ и через 60 мин смесь центрифугировалась 15 мин при 8000 об/мин. Затем к 1 мл супернатанта добавлялось 2 мл ТБК, раствор инкубировался на кипящей водяной бане 15 мин и после охлаждения фотометрировался при 532 нм против дистиллированной воды.

Результаты работы представлены в виде значений M ± SD (средняя ± стандартное отклонение). Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с применением непараметрических тестов Вилкоксона и Фишера для сравнения связанных и несвязанных величин. Для оценки корреляционных связей между показателями использовался коэффициент ранговой корреляции Спирмана. За статистически значимые принимались различия и корреляции при величине достигнутого уровня значимости р<0,05. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы JMP 5.1.2 для Windows (SAS Institute Inc., NC, USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Уровни ТБРП в плазме крови у новорожденных с гипоксией были значительно выше, а ОАА — ниже, чем у новорожденных без гипоксии в плазме пуповинной крови и на 7-е сутки после рождения (табл. 1).

Подобные результаты обнаружены у значительно недоношенных новорожденных с гестационным возрастом < 32 недель (n = 10) по сравнению со здоровыми новорожденными (n = 30). При этом у недоношенных новорожденных уровень ТБРП в пуповинной крови составил 0,56 ± 0,11 против 0,20 ± 0,06 нмоль/мл у здоровых новорожденных (р < 0,0001); ОАА 24,4 ± 1,7 против 29,9 ± 2,2 % (р < 0,0001). На 7-е сутки уровень ТБРП составил 0,76 ± 0,13 против 0,34 ± 0,06 нмоль/мл (р < 0,0001); ОАА 24,9 ± 1,4 против 44,2 ± 2,2 % (р < 0,0001).

Примечательно, что уровни ТБРП и ОАА в пуповинной крови были связаны с гестационным возрастом новорожденных (табл. 3). Причем связь между уровнем ТБРП на 7-е сутки после рождения и гестационным возрастом новорожденных усиливалась (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

В течение родов плод из относительной гипоксии попадает в относительную гипероксию. Высокие концентрации кислорода токсичны для тканей плода. Потенциальным механизмом токсичности и патофизиологического повреждения клеток является гиперпродукция свободных радикалов [4].

Свободные радикалы генерируются при гипоксии, ишемии-реперфузии, гипероксии, активированными нейтрофилами и макрофагами, при дисфункции митохондрий, в реакциях Фентона, при повреждении эндотелия, метаболизме ненасыщенных жирных кислот [15]. Свободные радикалы, пероксиды липидов и протеинов обусловливают деструкцию мембран и повреждение

Таблица 2

Уровни ТБРП и ОАА в плазме крови новорожденных при рождении и на 7-е сутки жизни*

	Гипоксия (n = 49)			Здоровые (n = 30)			р1
	При рождении	На 7-е сутки	р	При рождении	На 7-е сутки	р
ТБРП	0,46 ± 0,12	0,54 ± 0,21	< 0,0001	0,20 ± 0,06	0,34 ± 0,06	< 0,0001	< 0,0001
ОАА	25,2 ± 2,2	26,4 ± 2,5	< 0,0001	29,9 ± 2,2	44,2 ± 2,2	< 0,0001	< 0,0001

*ТБРП — тиобарбитурат-реактивные продукты, ОАА — общая антоиксидантная активность. Данные представлены в виде M ± SD. р — достигнутый уровень значимости различий в парных сравнениях по критерию Вилкоксона.

р1 — достигнутый уровень значимости межгрупповых различий величин ТБРП и ОАА по критерию Фишера.

Таблица 3

Корреляции между гестационным возрастом новорожденных с перинатальной гипоксией и уровнем ТБРП и ОАА при рождении и на 7-е сутки жизни (n = 49)*

	ТБРП при рождении	ТБРП на 7-е сутки жизни	ОАА при рождении	ОАА на 7-е сутки жизни
Гестационный возраст	–0,43 (0,0019)	–0,59 (<0,0001)	0,39 (0,0063)	0,35 (0,0150)

*Значения стандартизированы по коэффициенту корреляции Спирмана с величинами достигнутого уровня значимости р в скобках.

клеток. В ответ на оксидативный стресс клетки индуцируют антиоксидантные энзимы, однако гиперпродукция оксирадикалов приводит к повреждению протеинов, липидов и ДНК, что ведет к трансформации или гибели клетки посредством апоптоза или некроза [10].

Новорожденные подвержены повышенному риску оксидативного повреждения из-за дисбаланса антии прооксидантов, что обусловливает повреждение тканей [8]. В плазме новорожденных мало глутатионпероксидазы, супероксиддисмутазы, уЗ-каротина, рибофлавина, а-протеиназы, витамина E, Se, Cu, Zn, церулоплазмина и трансферрина [3].

Гиперпродукция свободных радикалов— важная особенность большинства (если не всех) болезней новорожденных [13]. Гипоксия – это один из факторов, включающих генерацию свободных радикалов в перинатальный период. В течение гипоксии снижение производства АТФ приводит к накоплению аденозина и гипоксантина [4], а продукт деградации АТФ является субстратом для ксантиноксидазы, продуцирующей оксирадикалов в фазу реперфузии [11, 12]. Другими источниками оксирадикалов являются цепь переноса электронов в митохондриях и реакции Фентона [10].

На первой неделе жизни у недоношенных новорожденных повышен риск развития оксидативного стресса из-за высоких концентраций кислорода в окружающей среде по сравнению с его уровнем in utero, оксигено-терапии и высоких концентраций свободного железа в эритроцитах и плазме крови [6].

Мы обнаружили повышенное содержание в плазме крови новорожденных ТБРП и низкую ОАА у новорожденных с гипоксией. Различия в уровне ТБРП и ОАА у новорожденных с гипоксией по сравнению со здоровыми сохранялись до 7 суток после рождения.

Отрицательная корреляция обнаружена между гестационным возрастом и уровнем ТБРП в пуповинной крови и на 7-е сутки после рождения. При этом отмечалась положительная корреляция между гестационным возрастом новорожденных и ОАА пуповинной крови на 7-е сутки после рождения. Это указывает, что дефицит антиоксидатнов при перинатальной гипоксии, возможно, обусловливает повышенное по сравнению со здоровыми новорожденными свободно-радикальное повреждение липидов тканей новорожденных в первую неделю жизни.

У новорожденных без гипоксии на 7-е сутки после рождения также наблюдается повышение уровня оксида-тивного стресса. Это, по-видимому, связано с переходом из относительной гипоксии in utero в условиях относительной гипероксии. Свидетельство персистирующего оксидативного стресса у новорожденных без гипоксии указывает на физиологичность этого феномена.

Следовательно, реанимация новорожденных должна проходить максимально осторожно, чтобы не усугублять оксидативный стресс, а вместо кислорода желательно использовать комнатный воздух [14]. Эти стратегии должны уменьшить генерацию оксирадикалов и оксидативный стресс.