Оксидативный стресс и патозооспермия

Туровецкий В.Б. – к.б.н., старший научный сотрудник Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Пирутин С.К. – к.б.н., старший научный сотрудник Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Предприняты многочисленные попытки нейтрализовать негативное влияние ОС: устранение этиопатогенетического фактора, например, варикоцеле, ИППП; этиотропное лечение антиоксидантами, которые, как клинически установлено, имеют значимый эффект. Он состоит в повышении подвижности сперматозоидов и улучшении их морфологии. Например, после проведения варикоцелэктомии отмечается повышение целостности ДНК сперматозоидов, снижение индекса фрагментации ДНК до нормального уровня [12-14].

В связи с изложенным, целью нашего исследования явилось определение уровня ОС и антиоксидантной активности эякулята при различных видах патозооспермии, обусловленной заболеваниями органов репродуктивной системы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования служил эякулят, полученный в соответствии с рекомендациями ВОЗ 5-го издания [15]. Всего обследовано 69 мужчин в возрасте от 20 до 45 лет. В группе пациентов с варикоцеле (14 человек) диагноз установлен по данным ультразвукового исследования (УЗИ) с цветной доплерографией венозного кровотока органов мошонки. Группа с азоспер-мией (11 человек) состояла из пациентов с необструктивной формой азооспермии. В группу с астенозо-оспермией (14 человек) входили пациенты без варикоцеле и хронического простатита. Группа с нормозо-оспермией (14 человек) представлена фертильными мужчинами. Отдельно выделена группа пациентов с варикоцеле (16 человек), которые были обследованы до и после вари-коцелэктомии.

Образцы эякулята после разжижения подвергали стандартному морфологическому изучению по рекомендациям ВОЗ. Тот же образец центрифугировали 25 мин при 3000 об/мин. Супернатант (спермо-плазму) отбирали по 200 мкл и оставляли в холодильнике при минус 80ºС для определения величин исследуемых биохимических параметров.

Биохимический анализ спер-моплазмы включал определение следующих параметров:

• 1.    Содержание общего белка – г/л,

• 2.    Активность супероксиддис-мутазы (СОД) – у.е./ мг белка,

• 3.    Содержание продуктов, образующихся в результате процессов перекисного окисления липидов

• 4.    Общая антиоксидантная активность (ОАА).

(ПОЛ) и реагирующих с 2-тиобар-битуровой кислотой (ТБК-АП) – мкМ аскор ОЕ.

Выбор параметров был обусловлен тем, что СОД является основным антиоксидантным ферментом, который ответственен за утилизацию супероксиданион-радика-ла. Количество ТБК-АП является маркером ОС, а определение ОАА позволяет оценить состояние антиоксидантной системы.

Исследование биохимических параметров спермоплазмы проводили на кафедре биофизики биофака МГУ им. М.В. Ломоносова с использованием ряда методов, описанных в работе M. Valko и соавт. [16].

Метод определения активности СОД основан на измерении количества продукта автоокисления адреналина в щелочной среде, при образовании которого происходит генерация супероксид-анион радикалов. Этот продукт автоокисления имеет максимум поглощения при 320 нм. Активность СОД оценивали по ингибированию процесса автоокисления адреналина добавлением образцов спермоплазмы и выражали в у.е. на мг белка, где за одну условную единицу активности фермента принимали такое его количество, которое необходимо для ингибирования образования продукта автоокисления на 50%. Расчет содержания ТБК-АП продуктов проводили с учетом коэффициента молярной экстинции МДА и выражали в нмоль/мл спермоплазмы. Оптическую плотность измеряли при 532 нм. Определение ОАА спер-моплазмы проводили методом, ко- торый основан на способности водорастворимых антиоксидантов восстанавливать Fe3+ до Fe2+. Измеряли образовавшийся окрашенный продукт комплекса восстановленного железа с 2,4,6-трипиридилти-разином, поглощающий при 593 нм. ОАА выражали в мкМ аскорбиновой кислоты согласно калибровочной кривой.

Все измерения оптической плотности проводили на спектрофотометре Hitachi 556 (Япония).

Для обработки полученных результатов применяли методы описательной статистики с использованием программ STATISTICA. Средние значения по группам представлены в виде М±s c исключением значений, отклоняющихся от средней арифметической более, чем на + 2s. Значимость различий между группами проверяли с помощью t – критерия Стъюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В таблице 1 представлены результаты исследования эякулята в виде среднеарифметических значений параметров и их среднеквадратических ошибок (М ± s), и проценты отклонения показателя в сравнении с величиной соответствующего параметра в группе пациентов с нормозооспермией.

Несмотря на небольшие объемы групп наблюдения, все основные показатели фертильности эякулята в группе пациентов с варикоцеле имели сниженный уровень по сравнению с показателями в группе нормозооспермии. В группе

Таблица 1. Морфологические параметры эякулята в разных группах пациентов

Параметр	Норма (14 чел.)	Варикоцеле (14 чел.)	Астенозооспермия (14 чел.)	Азооспермия (11чел.)
Объём эякулята, мл	4,7 ± 0,4 (100%)	3,3 ± 0,3* (70%)	5,1 ± 0,5 (108%)	2,7 ± 0,4* (57%)
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	72,7 ± 6,3 (100%)	64,5 ± 6,1 (88%)	45,7 ± 4,2* (63%)	0
Живые клетки, %	74,7 ± 2,9 (100%)	61,5 ± 3,5* (82%)	55,1 ± 1,9* (73%)	0
Активная подвижность клеток, %	31,0 ± 2,6 (100%)	11,5 ± 2,3* (37%)	5,4 ± 0,9* (17%)	0
Общая подвижность клеток, %	51,5 ± 3,8 (100%)	29,7 ± 2,5* (57%)	19,6 ± 2,1* (38%)	0
Нормальные формы клеток, %	34,1 ± 1,2 (100%)	26,4 ± 1,3* (77%)	21,3 ± 1,6* (62%)	0

*различие достоверно по сравнению с нормой ( р <0,05)

Таблица 2. Биохимические параметры спермоплазмы в разных группах пациентов

Показатель Норма (14 чел.) Варикоцеле (14 чел.) Астенозооспермия (14 чел.) Азооспермия (11чел.) Общий белок, г/л 63,5 ± 3,9 (100%) 56,3 ± 6,3 (88%) 64,3 ± 5,3 (101%) 57,6 ± 8,0 (90%) FRAP, ОЕ 1693 ± 121 (100%) 1549 ± 119 (91%) 1742 ± 128 (103%) 1760± 146 (104%) СОД, у.е./мг белка 2,24 ± 0,15 (100%) 2,65 ± 0,3 (118%) 2,42 ± 0,26 (108%) 2,43 ± 0,66 (108%) ТБК-АП, мкМ аскор ОЕ 2,23 ± 0,15 (100%) 2,06 ± 0,36 (92%) 2,27 ± 0,24 (101%) 2,33 ± 0,23 (104%) пациентов с астенозооспермией все показатели, кроме объема эякулята, также характеризуются существенно более низким уровнем в сравнении с нормой и варикоцеле. Следует отметить, что во всех обследованных группах в образцах эякулята уровень лейкоцитов находился в пределах нормативных показателей, т.е. не более 1 млн/мл.

В таблице 2 представлены данные о состоянии оксидантной и антиоксидантной систем в тех же группах пациентов. В группе с варикоцеле выявлено незначительное снижение антиоксидантной активности эякулята на фоне некоторого повышения СОД. При астенозооспермии наблюдали тот же уровень, что и при нормоспермии. При азооспермии также не наблюдалось существенных отличий от нормы. Концентрация белка во всех группах находилась на одном уровне, т.е. не зависела от вида патозооспермии и не имела достоверных различий.

В таблице 3 представлены величины морфологических парамет-

Таблица 3. Параметры эякулята у пациентов с варикоцеле (до и после варикоцелэктомии)

Показатель	Варикоцеле до операции (8 чел)	После варикоцелэктомии (8 чел.)
Объём эякулята, мл	3,3 ± 1,4 (100%)	3,6 ± 1,3 (109%)
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	68,6 ± 15,1 (100%)	65,0 ± 16,4 (95%)
Живые клетки, %	62,0 ± 11,5 (100%)	62,1 ± 6,7 (100%)
Активная подвижность клеток, %	10,6 ± 4,3 (100%)	13,5 ± 3,6 (127%)
Общая подвижность клеток, %	29,4 ± 5,5 (100%)	32,2 ± 4,2 (109%)
Нормальные формы клеток, %	25,6 ± 11,1 (100%)	28,0 ± 5,6 (109%)

Таблица 4. Биохимические параметры спермоплазмы при варикоцеле (до и после операции)

Показатель	Варикоцеле до операции (8 чел)	После варикоцелэктомии (8 чел.)
Общий белок, г/л	57,05 ±13,8 (100%)	56,7 ± 10,1 (99%)
FRAP, ОЕ	1548 ± 218 (100%)	2047 ± 332* (132%)
СОД, у.е./мг белка	3,2 ± 0,8 (100%)	2,4 ± 0,5* (75%)
ТБК-АП, мкМ аскор ОЕ	2,2 ± 0,8 (100%)	2,7 ± 0,5 (122%)

ров эякулята у пациентов отдельной группы до и после операции по поводу варикоцеле (послеоперационное обследование проведено через 3-6 месяцев). Не обнаружено значительного повышения всех показателей, однако можно выделить положительные сдвиги подвижности и морфологии сперматозоидов.

Таблица 4 демонстрирует изменения состояния оксидантной и антиоксидантной систем эякулята. Сравнивали биохимические показатели у пациентов с варикоцеле до операции и после операции. Обнаружено значительное повышение величины антиоксидантного показателя ОАА и ТБК-АП и одновременно существенное снижение показателя ОС (СОД). При этом концентрация белка достоверно не изменялась.

ОБСУЖДЕНИЕ

Резюме:

Введение. Анализ отечественной и зарубежной литературы последних лет свидетельствует о том, что окислительный стресс сопровождает и/или является одним из патогенетических звеньев в развитии многих видов репродуктивной патологии мужчин различного возраста. На состояние здоровья мужского населения оказывают влияние факторы, связанные с образом жизни, состоянием окружающей среды, генотипом популяции. Эти изменения выражаются не только в ухудшении функции сперматогенеза, но и в возникновении оксидативного стресса в крови и семенной жидкости мужчин репродуктивного возраста. Соответственно, специалисты по мужскому репродуктивному здоровью активно изучают основные аспекты диагностики и влияния оксидативного стресса (ОС) на фертильность мужчин с целью оценки возможного использования антиоксидантов для улучшения параметров эякулята.

Целью нашего исследования явилось определение уровня ОС и антиоксидантной активности эякулята при различных видах пато-зооспермии, обусловленной заболеваниями органов репродуктивной системы.

Материалы и методы. Материалом для исследования служил эякулят, полученный по параметрам рекомендаций ВОЗ 5-го издания. Всего обследовано 69 мужчин в возрасте от 20 до 45 лет. В группе пациентов с варикоцеле (14 человек) диагноз установлен по данным ультразвукового исследования с цветной доплерографией органов мошонки. Группа с азооспермией (11 человек) состояла из пациентов с необструктивной формой азооспермии. В группу с асте-нозооспермией (14 человек) входили пациенты без варикоцеле и хронического простатита. Группа с нормозооспермией (14 человек)

Summary:Oxidative stress and pathozoospermia

V.V. Evdokimov, O.B. Zhukov, Yu.V. Kastrikin, A.A. Bayzhumanov,

V.B. Turovetskiy, S.K. Pirutin

Introduction. The analysis of domestic and foreign publications indicates that oxidative stress is accompanying and/or plays one of pathogenic role in development of many types of reproductive disorders in men of various ethnic groups. The state of health of the male population affected by factors related to lifestyle, environment, population genotype. These changes are expressed not only in deterioration of spermatogenesis, but also in appearance of an oxidative stress signs in blood serum and ejaculate in men of reproductive age. Accordingly, specialists in male reproductive health are actively studying the main aspects of the diagnosis and effects of oxidative stress (OS) on male fertility, to assess the possible use of antioxidants to improve the parameters of the ejaculate. Accordingly, fertility specialists are actively exploring the diagnosis of such stress in spermatozoa and evaluating the possible use of antioxidants to ameliorate this condition.

The purpose of our research was definition of the OS level and antioxidant activity of the ejaculate at different types of the pathozoosper-mia caused by diseases of the organs of the reproductive system.

Marerials and metod. The material for the study was ejaculate, obtained from the parameters of the WHO recommendations of the 5th edition. A total of 69 men aged 20 to 45 years were examined. In the group of patients with varicocele (14 patients), the diagnosis was established per ultrasound with color Doppler ultrasound of the scrotal organs. The group with azoospermia (11 patients) consisted of patients with non-obstructive form of azoospermia. The group with astenozoospermia представлена фертильными мужчинами. Отдельно выделена группа пациентов с варикоцеле (16 человек), которые были обследованы до и после варикоцелэктомии.

Результаты. На основании полученных результатов можно предположить, что варикоцеле является этиологическим фактором, создающим условие для появления ОС, а варикоцелэктомия нейтрализует избыток АФК и уменьшает фрагментацию ДНК. Оксида-тивный стресс имеет место только в группе больных с варикоцеле, но не у пациентов с патозооспермией, что может указывать на патогенетическую роль хронической ишемии, сопровождающей варикоцеле, в инициации избыточной продукции АФК. Таким образом, при обнаружении варикоцеле, сопровождаемого астено-тератозооспермией, необходимо обследование пациента на предмет оценки степени фрагментации ДНК. Хирургическая коррекция варикоцеле приводит к повышению фертильности эякулята за счет снижения уровня ОС и увеличению числа клеток с нормальной упаковкой хроматина.

(14 patients) included patients without varicocele and chronic prostatitis. The group with normozoospermia (14 persons) is represented by fertile men. Separately, a group of patients with varicocele (16 people) who were examined before and after varicocelectomy were identified.

Results. Based on the results obtained, it can be assumed that varicocele is the etiological factor that creates a condition for the emergence of the OS, and varicocelectomy neutralizes the excess of reactive oxygen species (ROS) and reduces the fragmentation of deoxyribonucleic acid (DNA). Oxidative stress occurs only in the group of patients with varicocele, but not in patients with pathozoospermia, which may indicate the pathogenetic role of chronic ischemia accompanying varicocele, in initiating excess ROS production. Thus, when a varicocele is detected accompanied by asthenoteratozoospermia, it is necessary to evaluate the degree of DNA fragmentation. Surgical correction of varicocele leads to an increase in the fertility of the ejaculate due to a decrease in the level of OS, and an increase in the number of cells with normal packing of chromatin.