Олигонуклеотидные праймеры для детекции генов, кодирующих большую субъединицу бифенил 2,3-диоксигеназы, бактерий порядка Actinomycetales

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) входят в число наиболее опасных абиотичесих веществ, созданных человеком. Это высокотоксичные соединения, мутагены, канцерогены. Благодаря исключительной стабильности, устойчивости к воздействию химических и физических факторов, ПХБ долго остаются в окружающей среде [Ross, 2004]. Несмотря на запрет производства ПХБ во многих странах, проблема их утилизации остается актуальной [Васильева, Стрижакова, 2007]. Всестороннее изучение микроорганизмов-деструкторов бифенила/ПХБ является перспективным для создания эффективных технологий очистки окружающей среды от данных соединений.

У ряда грамположительных и грамотрицатель-ных бактерий изучены ферментные системы, контролирующие разложение бифенила/ПХБ [Pieper, 2005]. Так, бифенил 2,3-диоксигеназа (БДО) является ферментом, катализирующим первую реакцию окисления одного из ароматических колец бифени-ла/ПХБ с образованием дигидродиольного производного. Изучению этого фермента уделяется особое внимание, так как он определяет спектр утилизируемых бактериями конгенеров ПХБ. Бифенил 2,3-диоксигеназа – мультикомпонентный фермент, состоящий из трех белков: терминальной оксигеназы (BphA1/BphA2), ферредоксина (BphA3) и ферредоксин редуктазы (BphA4). Терминальная оксигеназа содержит α- и β-субъединицы (кодируются генами bphA1 и bphA2 , соответственно) и является

α 3 β 3 гексамером [Seeger et al., 2001]. α-Субъединица БДО состоит из 458 – 468 АКО, которые образуют два домена [Zielinski et al., 2002]. N-концевой домен включает в себя железо-серный кластер Риске [2Fe-2S] (с 40 по 140 АКО у Spingobium yanoikyae B1). Два остатка гистидина и два цистеина координируют атомы железа и серы, входящие в этот кластер. С-концевой домен включает каталитический карман, в котором находится негемовое железо (II), координированное двумя остатками гистидина (His-207 и His-212) и одним остатком аспарагиновой кислоты (Asp-360) [Ferraro et al., 2007] (рис. 1). Предполагается, что размер и форма каталитического кармана напрямую влияют на спектр окисляемых ферментом субстратов и на эффективность взаимодействия [Jaconcic et al., 2007], а пространственная структура белка и, соответственно, структура активного центра, в свою очередь, определяется взаимодействием аминокислот. Известно, что замены определенных аминокислот, влекут за собой изменение структуры активного центра и, соответственно, спектра окисляемых субстратов [Kimura et al., 1997; Suenaga et al., 2002].

Большие субъединицы (α-субъединицы) негемовых железосодержащих диоксигеназ, способных осуществлять гидроксилирование бензольного кольца ароматических соединений, составляют большое семейство эволюционно родственных аминокислотных последовательностей, которые делятся на четыре подсемейства. Ферменты, осуществляющие гидроксилирование ароматического кольца бифенила/ПХБ, относятся к подсемейству бифе-

нил/толуол диоксигеназ (Б/Т ДО) [Gibson, Parales, 2000].

Однако есть данные о бифенил 2,3-диоксигена-зах бактерий родов Sphingomonas , Bacillus , Rhodo-coccus , существенно отличающихся от ферментов подсемейства Б/Т ДО и сходных с фенантрен- и нафталин диоксигеназами бактерий-деструкторов полициклических углеводородов [Romine et al., 1999; Mukerjee-Dhar et al., 2005; Taguchi et al., 2007; Yang et al., 2007]. Так, уровень сходства между недавно описанными генами, кодирующими БДО Rhodococcus sp. R04 и генами Rhodococcus sp. RHA1, БДО которого относится к ферментам подсемейства Б/Т ДО, составляет менее 44% [Yang et al., 2007].

Известно, что гены БДО грамположительных и грамотрицательных бактерий существенно отличаются. Так, по данным Е. Masai с соавторами [1995] БДО бактерий рода Rhodococcus более сходны с толуол диоксигеназами грамположительных бактерий, чем с бифенил диоксигеназами протеобакте-рий. Нами были выделены и охарактеризованы грамположительные бактерии порядка Actinomycetales , способные активно разлагать би-фенил/ПХБ [Плотникова и др., 1998; 2001; 2005;

Шумковa, 2009]. При изучении генетических систем деструкции данных соединений у ряда штаммов рода Rhodococcus , способных к активной деструкции бифенила/ПХБ, не были выявлены гены, присутствующие в геноме хорошо исследованных бактерий-деструкторов ПХБ. Так, отсутствовала специфическая амплификация гена bphA1 при использовании вырожденных праймеров, сконструированных на основе анализа известных последовательностей α-субъединиц гидроксилирующих диоксигеназ бифенила/толуола/бен-зола/изопропилбензола (подсемейство Б/Т ДО) [Witzig et al., 2006]. В то же время у ряда исследованных бактерий порядка Actinomycetales (рода Rhodococcus , Janibacter ), а также у грамотрицатель-ных бактерий-деструкторов рода Pseudomonas была амплифицирована область гена bphA1 , располагающаяся в районе 668–1152 п.н. Исходя из данных M. Zielinski с соавторами [2002], размер гена bphA1 у разных бактерий составляет 1374–1404 п.н.). Ам-плифицированный участок гена кодирует 222–384 АКО α-субъединицы БДО. Это АКО С-концевого домена, формирующие активный центр фермента (рис. 1) [Шумковa и др., 2008; Шумкова, 2009].

ll^T

II

N

[2Fe-2S]

и Кластер Риске

Активный центр

20 40 6

80 100 120 140 1 60 1 80 200 220 240 260 280

400 420 440 460

*

11^1_______________ у

Рис. 1 . Схема строения α-субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназы [Zielinski et al., 2002] и исследуемые нами области:

заштрихованный и белый участки соответствуют каталитическому и Риске доменам, соответственно; короткие вертикальные линии, соединенные горизонтальной, показывают расположение лигандов железосерного кластера и мононуклеарного железа активного центра; I – исследованная нами ранее область, II – область, исследование которой планируется; длинными вертикальными линиями показано положение праймеров; внизу отображена нумерация АКО, соответствующая порядку их расположения в α-субъединице БДО Burkholderia xenovorans LB400

Таким образом, подбирая новые праймеры, мы ставили две цели:

• 1.    Амплифицировать часть гена, кодирующую N-концевой домен α-субъединицы БДО, включающий железо-серный кластер Риске. Это позволит получить более полную информацию о генах тех бактерий, у которых ранее был амплифицирован участок гена bphA1 , кодирующий активный центр.

• 2.    Получить ПЦР-продукт с другого участка гена тех бактерий, у которых ранее амплификации не наблюдалось. Это послужит основой для дальнейшего изучения полной нуклеотидной последо-

• вательности гена bphA1, а также позволит в дальнейшем проводить скрининг бактерий на присутствие генов, контролирующих деструкцию бифе-нила/ПХБ у бактерий порядка Actinomycetales.

Материалы и методы исследования

Программное обеспечение

Поиск генов bphA1 проводился с помощью программы BLAST в международной базе данных GenBank. Для выравнивания нуклеотидных последовательностей и поис- ка консервативных участков была использована программа VectorNTI 10 . Последовательности олигонуклеотидов подбирались вручную. Для анализа свойств праймеров использовалась программа OligoAnalyzer 3.1 (http:// com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/. Проверка комплементарности праймеров соответствующим генам проводилась с помощью программы Primer-BLAST

.

Результаты и обсуждение

Подбор праймеров

Поскольку bphA1 гены грамположительных и гра-мотрицательных бактерий имеют существенные отличия [Masai et al., 1995], подбор праймеров проводился на основе известных нуклеотидных последовательностей генов α-субъединиц БДО, депонированных в международной базе данных GenBank, грамположительных штаммов: Rhodo-coccus globerulus P6 [X80041], R. erythropolis TA421 [D88021], R. erythropolis TA421 [D88020], R. aetherivorans I24 cosmid 2G11 [AF452376], Rho-dococcus sp. RHA1 [D32142], Rhodococcus sp. R04 [DQ403247], Rhodococcus sp. HA99 [AB272986], R. erythropolis TA431 [AB272985], R. rhodochrous K37 [AB272984].

Было проведено множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей (ген bphA1 и прилегающие к нему с краев участки длиной 230 п.н.) перечисленных выше бактерий. Найдено несколько консервативных областей без делеций, длина которых составляла 26–53 п.н., что достаточно для подбора праймера: 1) 377–430 п.н., 2) 452– 495 п.н., 3) 530–582 п.н., 4) 593–633 п.н., 5) 746–773 п.н., 6) 900–926 п.н., 7) 1410–1433 (рис. 2).

Рис. 2 . График сходства выравненных нуклеотидных последовательностей гена bphA1 :

по оси х – показатель сходства (Similarity) с консенсусной последовательностью – рассчитывался следующим образом: значения от 0 до 1, присвоенные каждому нуклеотиду (1 – идентичность, 0.5 – сходство, 0.2 – слабое сходство) суммированы и поделены на количество последовательностей в выравнивании; по оси у – порядковый номер нуклеотида от начала гена; стрелками показано положение праймеров; номерами (1–7) обозначены консервативные области

При подборе праймеров мы руководствовались рекомендациями [Kwok et al., 1994; Патрушев, 2004; Linhart, Shamir, 2005]. Кроме того, старались минимизировать вырожденность праймеров [Compton, 1990] и подобрать их таким образом, чтобы 3'-конец праймера не содержал нуклеотидных замен, т.е. максимально соответствовал участку, на который он будет отжигаться. На 5'-конце допускали несоответствия матрице. Необходимо было, чтобы амплифици-руемая область гена перекрывалась с ранее исследованным нами участком гена bphA1 , а положение прямого праймера было максимально близко к началу гена. С учетом поставленных задач для подбора праймеров подходили консервативные области № 1, 2 и 6. При соблюдении данных условий нам удалось подобрать несколько вариантов прямого, forvard(F) – праймера и один обратный revrse(R)-праймер (рис. 3): BphA1F409 5'-TTCTTGGCTGYTKHTSGSNCA-3', BphA1F450 5'-CCGGCGACTTYATSACSAMSTACAT-3', BphA1F462 5'-TGACCACGTACATGGGBGARGA-3', BphA1R900 5'-TCSGCDGCRAWYTTCCAGTT-3'.

Анализ термодинамических характерик и вторичной сруктуры подобранных праймеров

Далее мы провели анализ термодинамических параметров и вторичной структуры вышеперечисленных олигонуклеотидов (таблица). Forvard-праймер BphA1F409 позволяет амплифицировать максимально длинный участок гена bphA1, однако по сравнению с BphA1F450 и BphA1F462 обладает большой вырожденностью, худшими термодинамическими характеристиками. Вырожденный праймер – это смесь нуклеотидных последовательностей, каждая из которых представляет собой индивидуальный праймер. Чем выше «степень вырожденности» (число индивидуальных праймеров в смеси), тем сильнее падает эффективность ПЦР из-за снижения эффективной концентрации праймера. Рекомендуется, чтобы степень вырожденности не превышала 512 [Compton, 1990]. Также, в случае BphA1F409 разница между максимальной и минимальной температурой плавления индивидуальных вариантов праймера в общей смеси будет наибольшей: почти 11ºС по сравнению с 3.9ºC и 4.5ºC в случае BphA1F450 и BphA1F462, соответ- ственно (таблица), что может вызвать трудности при подборе температуры отжига в ПЦР.

AB 272985] _Rh о do с ос c us_eryt hro po lts_T A431 [DQ403247]_Rhodococcus_sp ,_R04 [D88021]_Rhodococcus_errthropois_TA421 [A F452376] _Rh о do с ос c us_ae t herivoran s_I24 [D 3 2142 ] _Rh od о co c cu s_sp ._RHA 1 [D8 80 20]_Rhodococcus_er>thropois_TA421 ГХ800411 Rjipdococcus oloberulus P6 [A В 27 29 8 6] _Rn о do с ос c us_sp, _H A 99 [A B2729 8 4] _Rh о do с ос c us_rh о do c hro us_K37

GTGGACC GAGATGTCTA C GA GCT CGAGС TC GA GO G CC ТС ТГС GC С АЛ ТА СC TG G CTGTTTCTC GG GСЛ GTGGACCGAGATGTCTACGAGCTCGAGCTCGAGCGCLTCTTCGCLA#TACCTGGCTGTTTCTCGGGC# i ACCGATCAGGCAATCTACGAGCGAGAGCTCGAGCAAGTTTTCGGGCC GAGTTGGCTGTTCCTCGCACJ I ACC^jACGAGGCGCTGTACGAACAGGAACTGGAGCGGATCTTCGGTC( CTCGTGGTTGCTGATGGGCCJ । ACCBACGAGGCGCTGTACGAACAGGAACTGGAGCGGATCTTCGGTC( CTCGTGGTTGCTGATGGGC CJ । A CgIaC GAGGCGCTTTACCAGCAGGAACTCGAGCTCATCTTCGGTCC GTCCTGGCTCCTGTTGGGGCJ ।

CGTGAGC CGTGAGC CGATTCG CGAGACG CGAGACG CGAGACG

GTGGACCGAGATGKTACC4GCTCGAGCTCGAGCGCCTCTTCGCCM TACCTGGCTGTTTCTCGGGCj CGTGAGC

(361) GTGGACCGAGATGTCTACGAGCTCGAGCTCGAGCGCCTCTTCGCCAj TACCTGGCTGTTTCTCGGGCj CGTGAGC

BphA1F409

[AB272985]_Rhodococcus_erythropolis_T A 431 (397) [DQ403247]_Rhod0CDCCUS_sp._R04 (385)

[D88021LRhodococcus_erythropolis_T A421 (331) [A F452376 ] _Rh od о co с c us_ae t herivoran s_I24 (401) [D32142]_Rhodococcus_sp ._RHA1 (363)

[D88020]_Rhodococcus_erythropolis_T A421 (380) [X 80041 ] _Rho d ос о cc и s_g Io be rulu s_P6 (380) [AB272986]_Rhodococcus_sp ,_HA99 (352) [AB272984]_Rhodococcus_rhodochrous_K37 (430)

GTGAGCLAGGTCGCCGlAtCGGGCGACTTTA

BTGAGCCAGGlCGCCGiAt CGGGCGACTTTA

TCACCACGTACAT

TCACCACGTACAT

GATTCGCAACTTCCGAAA( GCGGCAGCTTCGTGCAGACCTACAT

GAGAC GC AGArTC CGAAGlCC GGC GACTTCA GAGACGCAGATTC CGAAGt CCGGCGACTTCA GAGACGCAAATCCCGAAGt CCGGCGACTTCA gagacgIlaatcccgaagi CCGGCGACTTLA GTGAGCCAGGTCGCCGAAC CGGGCGACTTTA

ГGACGAAСТАCAT ГGACGAACTACAT ГGACCCAGTACAT ГGACCCAGTACAT TCACCACGTACAT

rGGTGAAGA [TCCGTTATCGTCTCCHCGGT rGGGGAAGA [TCCGTTATCGTCTCCCGCGGT jggtgagga :cctgtacttgttgtgcgacag rG G C GA GGA ГС С C GTG ATG GTC GTTC GT C A G rGG C GA GGA ГС С C GTG ATG GTC GTTC GT C A G rGGTGAGGA ^CCGGTTATCGTCTCGCGGCAG rG GT GA GGA JCCGGTTATCGTCTCGCGGCAG iGGTGAAC-A [TCCGTTATCGTCTCCCGCGGT

GTGAGCCAGGTCGCCGAAC CGGGCGACTTTA TZACCACGTACAT iGGTGAAGA'TCCGTTATCGTCTCCCGCGGT

BphA1F450

[AB272985]_Rhodococcus_e ryt hrupolis_T Д43 1 [DQ40 3 2 47]_Rhodococcus_sp._R]0 4 [D8 80 2 1 J_Rhodococcus_e ryt hropolis_T A42 1

[AF452376 ]_Rhodococcus_a et herivorans_I24 [D3 2 14 2 ]_R hodococcu s_s p ._RH Al

[D88020]_Rhodococcus_e ryt hropolis_T A421

ГХ800411 Rhodococcus doberulus P6 [ AB272986 ]_R hodococcu s_s p. _H A99 [AB272984]_Rhodococcus_rhodochrous_K37

BphA1F462

ACССТCGAGAС AACTGGAAGAT CGC C GCCGAGIAACTT CGCC-GCCGACATСТАCCACGTCGAАСАС TCGCACGC ACCGTCCAСАС( AACTGGAAGATCGCCGCCGAGAACTTCGCC-GCCGACATGTACCACGTCGAACACTCGCACGC GT TATC GACTG( AACTGGAДАТT T GCA TCCGAGCAGT-CTGCGAGCGACATGTA TCACGT GС-С TTТСTС СC

GT CAT T С C CT Gt ДАС T G GAAGT T C GC AG C GGAG CAAT T C TGC - A GC GA CAT GTA CCAC G C GG- G iZAC CA CAT С С C GTCATTССДТG( AACTGGAAGTTCGCAGCGGAGCAATTCTGC-AGCGACATGTAСCACGCGG-GCACCACATССC GTCAT CCAGTGiAACTGGAAGT TCGCAGCGGAGCAGTT CTGC-TCTGATATGTACCACGTCG-GCACGACGTCAC

GTCAT CCAGTG( AACTGGAAGT TCGCAGCGGAGCAGTTCTGC-TCTGATATGTACCACGTCG-GCACGACGTCAC ACC GT C GA CAC ( AAC T G GAAGATC GC C GC CGAG AAC T T C GC C - GCC GA CAT GTA CCAC G TCGAACAC TC GCAC G C ACC GT C GA CAC( AAC T G GAAGAT C GC C GC CGAG ДАС T T C GC C- GCC GA CAT GTA CCAC G TC GAACAC TC GCAC G C

BphA1R900

Рис. 3 . Фрагменты выравнивания нуклеотидных последовательностей генов bphA1 :

консервативные нуклеотиды выделены цветом, участки, комплементарные праймерам, выделены прямоугольниками и стрелками

Ни один из forvard-праймеров не образует тугоплавких шпилек (с ∆G меньше –7 kcal.mole ^-1 ). Однако для каждого из сконструированных праймеров имеются индивидуальные варианты, образующие тугоплавкие гомо- или гетеродимеры (таблица). Оптимальным в этом отношении является BphA1F462, который при степени вырожденности 6 образует 1 гетеродимер, характеризующийся свободной энергией Гиббса ∆G –10.13 kcal.mole ^-1 . BphA1F409 образует 11 вариантов (из 192) гомо- и гетеродимеров с ∆G меньше –7 kcal.mole ^-1 , что может вызвать затруднения на стадии отжига данных индивидуальных вариантов праймера. Однако BphA1F462, по сравнению с BphA1F450 и BphA1F462, позволяет амплифици-ровать наиболее короткий фрагмент гена bphA1 .

Проверка специфичности праймеров

В результате проверки комплементарности праймеров к имеющимся в базе GenBank генам bphA1 , было выявлено, что сконструированные нами олигонуклеотиды в разной степени специфичны генам, кодирующим α-субъединицы негемовых железосодержащих диоксигеназ.

Пара праймеров BphA1F409 и BphA1R900 в подавляющем большинстве случаев была компле- ментарна bphA1 генам грамположительных бактерий (рода Rhodococcus, Arthrobacter). Но среди найденных с их помощью нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank, были соответствующие гены bphA1 грамотрицательных бактерий Comamonas testosteroni и Dyella ginsengi-soli, а также участок транспозона Tn4371, содержащего гены деструкции бифенила, грамотрица-тельной бактерии Ralstonia oxalatica. Длина ожидаемого ПЦР-продукта составляла 492 или 507 п.н.

Праймеры BphA1F450 и BphA1R900 также в большинстве случаев были комплементарны bphA1 генам грамположительных бактерий (рода Rhodococcus, Janibacter). Однако среди найденных в GenBank нуклеотидных последовательностей было несколько bphA1 генов грамотрицательных бактерий родов Pseudoxanthomonas и Dyella; гены α-субъединиц неизвестной гидроксилирующей диоксигеназы, фенилпропионат диоксигеназы и хлорбензол диоксигеназы грамотрицательных бактерий родов Rhizobium, Bordetella и Pseudomonas, соответственно. Размер ожидаемого ампликона составил 445 – 466 п.н. Вероятен также неспецифический отжиг на ДНК грамотрицательных бактерий рода Pirellula (с длиной ожидаемого про- дукта реакции 1432 п.н.), Starkeya (2691 п.н.) и ар- хей Methanocella (4614 п.н.).

Анализ термодинамических характеристик и вторичной структуры подобранных праймеров

Параметры	BphA1F409	BphA1F450	BphA1F462	BphA1R900
Длина, п.н.	21	25	22	20
Степень вырожденности	192	32	6	48
Содержание GC, %	51.6	52.0	55.3	51.7
T m (макс. – мин.) средн. ,ºC	54.2 – 65.1 59.3	58.8 – 62.7 60.7	58.0 – 62.5 60.5	55.5 – 62.0 58.2
Разница между мин. и макс. T m , ∆T m , ºC	10.9	3.9	4.5	6.5
Шпильки (шп.): количество вариантов, ∆G (kcal.mole -1 )	–	–	1 шп., ∆G -1.37	–
Гомодимеры (д.), количество вариантов, ∆G (kcal.mole -1 ), кол-во спаренных оснований (сп. осн.)	1 д.: ∆G -14.86, 7 сп. осн. 3 д.: ∆G -7.81 – -8.86 4    сп. осн.; 7 д.: ∆G -4.24 – -6.21, 3    сп. осн. 4    д.: ∆G -3.14, 2    сп. осн. 5    д.: ∆G -1.76 – - 2.42, 2 сп. осн.	3 д.: ∆G -7.28 – -9.75, 4 – 6 сп. осн. 2 д., ∆G -4.68 – -5.52, 3 – 4 сп. осн. 11 д., ∆G -3.0 – -3.88, 2 – 3 сп. осн. 4 д., ∆G -1.47 – -1.76, 2 сп. осн.	5 д.: ∆G -5.02 – -6.3, 3 – 4 сп. осн. 7 д.: ∆G -1.34 – - 2.88, 2 сп. осн.	1 д.: ∆G -17, 7 сп. осн. 1 д.: ∆G -14.42, 6 сп. осн. 2 д.: ∆G -8.13 – -8.77, 4    – 6 сп. осн. 5    д.: ∆G -4.92 – -6.82, 3 – 5 сп. осн. 5 д.: ∆G -3.34 – -3.52, 2    – 3 сп. осн. 3    д.: ∆G -1.94 – -2.78, 2    сп. осн.
Димеры с BphA1R900, количество вариантов, ∆G (kcal.mole -1 ), кол-во спаренных оснований (сп. осн.)	4 д.: ∆G -10.87 – -13.66, 5 – 7 сп. осн. 3 д.: ∆G -8.13 – -8.87, 4 сп. осн. 6 д.: ∆G -4.54 – -6.62, 3 – 4 сп. осн. 5 д.: ∆G -3.55 – -3.34, 2 – 3 сп. осн. 6 д.: ∆G -1.34 – -2.39, 2 сп. осн.	1 д.: ∆G -7.28, 5    сп. осн. 6    д.: ∆G -5.1 – -6.75, 3 – 4 сп. осн. 7    д.: ∆G -3.14 – -3.7, 2 – 3 сп. осн. 16 д.: ∆G -1.34 – -2.94, 2 – 3 сп. осн.	1 д.: ∆G -10.13, 6 сп. осн. 3 д.: ∆G -4.45 – -5.4, 3 сп. осн. 10 д.: ∆G -3.07 – -3.91, 2 – 3 сп. осн. 14 д.: ∆G -1.34 – - 2.88, 2 сп. осн.	–
Разница T m c BphA1R900, ∆T m (макс. – мин.), ∆T m средн., ºC	-1.5 – 3.1 1.1	3.3 – 0.7 2.5	2.5 – 0.5 2.3	–
Порядковый № АКО (от N-конца белка BphA1), соответствующего 5'-концу праймера	59	73	77	230
Порядковый № нуклеотида (от начала гена bphA1 ), соответствующего 5'-концу праймера	179	220	232	690

Примечания. Степень вырожденности праймера рассчитывали, перемножая количество вариантов нуклеотидов в каждой позиции. T _m - температура плавления.

Пара праймеров BphA1F462 и BphA1R900 оказалась наименее специфичной к bphA1 генам грамположительных бактерий. Среди данных, найденных с помощью нуклеотидных последовательностей сконструированных праймеров, было 7 генов α-субъединиц БДО бактерий рода Rhodococ-cus и 1 ген bphA1 бактерий рода Arthrobacter . По результатам проверки можно предположить, что с такой же долей вероятности праймеры с будут отжигаться и на гены bphA1 грамотрицательных бактерий: с помощью программы Primer-BLAST было найдено 9 bph -генов бактерий рода Pseudomonas, по 2 гена Burkholderia и Dyella , по 1 гену Comamo-nas , Pandoraea , Cupriavidus , Achromobacter , bphA1 ген некультивируемых бактерий и 9 генов, кодирующих синтетический конструкт BphA. Кроме того, возможен отжиг праймеров на гены больших субъединиц гидроксилирующих диоксигеназ кумола ( cumA1 ), этилбензола ( edoA1 ) и изопропилбензола грамотрицательных бактерий Pseudomonas fluorescens , гены α-субъединиц гидроксилирующих диоксигеназ Polaromonas naphthalenivo-rans и некультивируемой бактерии, на ДНК Pseu-doxanthomonas spadix, на интегративные и конъю-гативные элементы грамотрицательных бактерий Ralstonia и Acidovorax . Размер ожидаемого ПЦР-продукта составил 439 – 454. Вероятен неспецифический отжиг данной пары праймеров на ген рибосомального белка Pirellula staleyi с длиной ожидаемого продукта реакции 1432 п.н.

Заключение

Нами подобраны вырожденные праймеры для амплификации участка гена bphA1 , кодирующего N-концевой домен α-субъединицы БДО с расположенным в нем кластером Риске. Анализ термодинамических параметров и вторичной структуры олигонуклеотидов позволяет предположить, что амплификация фрагмента гена bphA1 с высокой вероятностью пройдет успешно. Все праймеры подходят для детекции генов, кодирующих каталитические субъединицы ферментов подсемейства Б/Т ДО у бактерий порядка Actinomycetales . Для скрининга генов bphA1 более всего подходит пара BphA1F409 и BphA1R900. Планируется экспериментальная проверка праймеров.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ-Урал №11-04-96028 «Новые физиологические и молекулярно-биологические свойства бактерий-деструкторов (хлор)ароматических соединений».