Опиоидные пептиды в регуляции секреторной активности макрофагов перитонеальной полости мышей при стрессе

Стресс как типовой комплекс неспецифических защитно-приспособительных и патологических реакций организма на факторы, несущие угрозу его существованию, реализуется при обязательном участии нейроэндокринной системы, неотъемлемым звеном которой являются эндогенные опиоидные пептиды. Одна из актуальных проблем современной нейроиммунологии – регуляция опиоидными пептидами иммунологических реакций на уровне целостного организма и их роль в регуляции иммуногенеза при стрессе. В настоящее время выделяют три типа опиатных рецепторов, экспрессирующихся на клетках нервной и иммунной систем (δ-, μ-, κ-), к каждому из которых в организме имеются свои высокоафинные лиганды. Во время стресса в периферическую кровь секретируются только продукты расщепления проопиомеланокор-тинпа (АКТГ, β-эндорфин), в то время как в ЦНС после стрессорного воздействия существенным ко- лебаниям подвержены уровни как эндорфинов, так и динорфинов [Peijie et al., 2003]. При развитии общего адаптационного синдрома β-эндорфин и динорфин А оказывают тормозящее действие на гипоталамо-гипофизарную ось, угнетая секрецию кортикотропин–рилизинг–фактора (КРФ) в гипоталамусе через налоксонзависимый механизм [O`Connor, O`Halloran, Shanahan, 2000]. Существенно отличаются эффекты данных пептидов, которые они оказывают на эмоциональное состояние и поведенческие реакции. Так, эндорфины снижают возбуждение в ЦНС, потенцируют адаптацию в ответ на неоднократную экспозицию стрессом у крыс, в то время как избыток динорфинов приводит к развитию депреcсии [Bali, Randhawa, Jaggi, 2016].

Цель работы – исследование влияния динорфи-на А (1-17) и β-эндорфина на стресс-индуци-рованную продукцию активных форм кислорода

(АФК), IL-i p и IL-10 стимулированными и не стимулированными перитонеальными лейкоцитами мыши in vivo.

Материал и методы

Исследования были выполнены на белых беспородных мышах средней массой 21–23 г, которых содержали в условиях лабораторного вивария. Все эксперименты были проведены в соответствии с действующими рекомендациями и этическими нормами. β-эндорфин (Skytek laboratories, США) вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 150 мкл в дозах 100, 0.0005 мкг/кг, динорфин А 117 (Sigma) – в дозах 1 и 0.0001 мкг/кг за 1 ч. до 2 ч. иммобилизации [Гейн и др., 2010, 2011], животные контрольной группы получали физиологический раствор в аналогичном объеме. Все животные были поделены на 6 групп: 1 – контроль, 2 – им-мобилизационный стресс, 3 – введение β-эндорфина в дозе 100 мкг/кг, 4 – введение β-эндорфина в дозе 0.0005 мкг/кг, 5 – введение β-эндорфина в дозе 100 мкг/кг с последующей иммобилизацией, 6 – введение β-эндорфина в дозе 0.0005 мкг/кг с последующей иммобилизацией. Иммобилизацию проводили в течение 2 ч. в положении лежа на спине. После иммобилизации всех животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным наркозом. Перитонеальные лейкоциты, где доминирующей фракцией являются перитонеальные макрофаги, выделяли по стандартной методике [Кондратьева, Ярилин, 2004].

Продукцию АФК перитонеальными лейкоцитами оценивали с помощью реакции люминолза-висимой хемилюминисценции (ЛЗХЛ). Реакцию проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах (“Microlite”, США), в каждую лунку которых вносили 105 клеток. Для индукции дыхательного взрыва в лунки дополнительно вносили опсонизированный зимозан (ОЗ) в концентрации 150 мкг/мл. В качестве маркёра выраженности реакции ЛЗХЛ использовали люминол (10–5 М), свечение которого неизбирательно по отношению к разным кислородсодержащим радикалам. Регистрация результатов проводилась в течение 1 ч. на многофункциональном спектрофотометре TECAN (Австрия).

Культивирование перитонеальных лейкоцитов для анализа секреции IL-1β и IL-10 осуществляли по стандартной методике. Каждая культура содержала 5 x 10 5 клеток в 0.2 мл полной культуральной среды, которую готовили ex tempore на основе среды RPMI 1640 с добавлением 10 mM HEPES, 2 mM L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина, меркаптоэтанола (10^-3М) и 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки. В качестве индуктора использовали ОЗ в концентрации 150 мкг/мл. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5%

CO 2 при 37°C в течение 24 ч. Количественное определение цитокинов в супернатантах клеточных культур проводили методом твердофазного имму-ноферментного анализа с помощью иммунофер-ментных тест-систем для мышей по методике, предложенной производителем («R&D», США).

Полученный материал обрабатывали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа для непарных данных и LSD-критерия для post-hoc сравнения.

Результаты и их обсуждение

Установлено, что 2-часовой иммобилизацион-ный стресс статистически значимо снижал спонтанную продукцию АФК лейкоцитами перитонеального смыва на начальном этапе и на 50-й минуте наблюдения (рис. 1, А). Введение мышам β-эндорфина в дозе 100 мкг/кг перед иммобилизацией приводило к стимуляции уровня АФК по сравнению с животными контрольной группы с 20 по 60 мин. наблюдений. В то же время предварительное введение животным пептида в дозе 0.0005 мкг/кг с последующей иммобилизацией уровни АФК достоверно не изменяло. Изолированное введение мышам β-эндорфина в дозе 100 мкг/кг не оказывало статистически значимого эффекта на уровень АФК в спонтанных культурах, в то время как в дозе 0.0005 мкг/кг пептид стимулировал спонтанную продукцию кислородных радикалов по сравнению с контрольной группой в течение всего периода наблюдений (рис. 1, А). В стимулированных зимозаном культурах у иммобилизированных мышей секреция АФК также снижалась (рис. 1, Б).

Введение животным β-эндорфина в дозе 100 мкг/кг за 1 ч. до иммобилизации эффекты стресса не модифицировало, но доза 0.0005 мкг/кг приводила к усилению продукции АФК при стрессе в первые минуты наблюдений. Изолированное введение β-эндорфина в дозе 100 мкг/кг приводило к усилению стимулированной секреции АФК только на 10 мин. наблюдений, в то время как доза 0.0005 мкг/кг выраженно активировала стимулированную продукцию АФК с 10 по 60 мин. эксперимента. Динорфин А нивелировал стрессиндуцированное угнетение респираторного взрыва в спонтанных и индуцированных культурах, помимо этого, изолированное введение животным пептида в низкой дозе 0,0001 мкг/кг усиливало продукцию АФК в зимозан-индуцированных пробах (рис. 2 А, Б).

Таким образом, введение β-эндорфина, как и динорфина А, перед воздействием стрессового фактора ослабляет угнетающие эффекты стресса на образование реактивных радикалов кислорода. В то же время необходимо отметить, что низкая доза β-эндорфина, сопоставимая с концентрацией пептида в периферической крови при стрессе оказывает самостоятельное стимулирующее влияние на микробицидный потенциал клеток. Динорфин А в низкой дозе так же усиливал интенсивность респираторного взрыва, однако, его эффект был менее выраженным, нежели у β-эндорфина.

А

время инкубации, мин

Б

Рис. 1 . Влияние β-эндорфина и иммобилиза-ционного стресса на спонтанную (А) и стимулированную (Б) продукцию активных форм кислорода перитонеальными лейкоцитами мыши (n = 9).

По оси ординат: относительные единицы люми-нисценции (RLU). По оси абсцисс: время наб-лююдения (мин); * – р ≤ 0.05 по LSD-критерию к контрольной группе. Группы: • – контроль, + – иммобилизация, □ – β-эндорфин 100 мкг/кг, ∆ – β-эндорфин 0.0005 мкг/кг, ■ – β-эндорфин 100 мкг/кг + иммобилизация, ▲ – β-эндорфин 0.0005 мкг/кг + иммобилизация

Спонтанная и стимулированная продукция IL-1β на фоне стресса снижалась (табл. 1, 2). Во всех группах животных, получавших β-эндорфин, спонтанная продукция IL-1β также была снижена по сравнению с контрольными, но не стрессированными животными. В стимулированных культурах предварительное введение животным перед иммобилизацией β-эндорфина в дозе 100 мкг/кг эффект стресса нивелировало, в то время как введение низкой дозы β-эндорфина (0.0005 мкг/кг) - приводило к еще более выраженному снижению уровней

IL-1β. При стрессе на фоне введения динорфина А уровни спонтанной продукции IL-1β оставались низкими по отношению к животным контрольной группы, и от группы животных, подвергнутых стрессу, статистически значимых отличий не выявлено. К угнетению спонтанной продукции IL-1β приводило изолированное введение динорфина А в высокой дозе. Стимулированная продукция IL-1β угнеталась в группе животных, подвернутых стрессу на фоне высокой дозы динорфина А, по отношению к группе контроля, но не стрессированным животным. Изолированное введение ди-норфина А на стимулированную продукцию IL-1β не влияло.

А

Б

время инкубации, мин

Рис. 2 . Влияние динорфина А и иммобилиза-ционного стресса на спонтанную (А) и стимулированную (Б) продукцию активных форм кислорода перитонеальными лейкоцитами мыши (n = 9).

По оси ординат: относительные единицы люми-нисценции (RLU). По оси абсцисс: время наблюдения (мин); * – р ≤ 0.05 по LSD-критерию к контрольной группе. Группы: • - контроль, х -иммобилизация, □ – динорфина А 1 мкг/кг, ∆ – динорфина А 0.0001 мкг/кг, ■ – динорфина А 1 мкг/кг + иммобилизация, ▲ – динорфина А 0.0001 мкг/кг + иммобилизация

Продукция супрессорного цитокина IL-10 в спонтанных клеточных культурах иммобилизиро- ванных животных статистически значимо не отли- которые получали β-эндорфин, наблюдалось вы-чалась от контроля. В то же время у всех мышей, раженное снижение спонтанной продукции IL-10.

Таблица 1

Влияние динорфина А на фоне иммобилизационного стресса на спонтанную и стимулированную продукцию IL-1 β и IL-10 перитонеальными лейкоцитами мыши (n=8)

Группа	Условия культивирования	IL-1 β , пг/мл	IL-10, пг/мл
Контроль	Без индуктора Зимозан	140.78±45.52 262.84±60.05	126.09±32.59 207.24±52.85
Стресс	Без индуктора Зимозан	29.44±12.40* 137.08±15.14*	146.19±36.95 292.31±64.69
Ддинорфин А 1 мкг/кг	Без индуктора Зимозан	55.76±8.22* 148.82±43.73	37.65±13.33* 87.65±18.27*
Динорфин А 0,0001 мкг/кг	Без индуктора Зимозан	95.71±16.26 187.92±35.99	61.99±12.20 220.25±68.33
Стресс + динорфин А 1 мкг/кг	Без индуктора Зимозан	49.11±11.28* 106.18±7.36*	78.44±13.80 117.99±22.94
Стресс + динорфин А 0,0001 мкг/кг	Без индуктора Зимозан	62.57±7.42* 165.79±19.74	64.75±12.81 165.47±51.07

Примечание. * – < 0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 2

Влияние β-эндорфина на фоне иммобилизационного стресса на спонтанную и стимулированную продукцию IL-1 β и IL-10 перитонеальными лейкоцитами мыши (n=8)

Группа	Условия культивирования	IL-1 β , пг/мл	IL-10, пг/мл
Контроль	Без индуктора Зимозан	159.69±47.12 339.93±49.20	170.53±43.10 289.50±49.63
Стресс	Без индуктора Зимозан	46.62±16.80* 219.83±15.12*	142.58±34.27 274.55±40.28
β -эндорфин 1 мкг/кг	Без индуктора Зимозан	59.86±15.16* 252.46±37.92	62.19±8.34* 250.85±66.70
β -эндорфин 0,0001 мкг/кг	Без индуктора Зимозан	40.51±1.63* 270.08±63.12	62.05±5.01* 490.47±109.65*
Стресс + β -эндорфин 1 мкг/кг	Без индуктора Зимозан	55.15±12.96* 294.59±19.24	80.31±5.33* 323.80±78.62
Стресс + β -эндорфин 0,0001 мкг/кг	Без индуктора Зимозан	34.10±7.91* 91.56±7.14*#	65.67±2.62* 84.49±10.36*

Примечание. * – < 0,05 по сравнению с контролем.

Интересные результаты в отношении продукции IL-10 были получены в условиях стимуляция клеток ОЗ. Иммобилизация не оказывала статистически значимого эффекта на уровни IL-10 в супернатантах активированных клеток. Введение животным только β-эндорфина в дозе 0.0005 мкг/кг приводило к статистически значимому повышению уровня IL-10 в супернатантах клеточных культур. А у мышей 6-й группы, которым вводили пептид в дозе 0.0005 мкг/кг с последующей иммобилизацией, наблюдалось выраженное угнетение секреции IL-10 как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с животными 4-й группы. Высокая доза β-эндорфина (100 мкг/кг) на стимулированную продукцию IL-10 влияния не оказывала. Динорфин А при введении в дозе 1

мкг/кг угнетал продукцию IL-10 как в спонтанных, так и в стимулированных культурах, введение животным динорина А на фоне стресса на продукцию IL-10 не влияло.

Заключение

Таким образом, опиоидные пептиды модулируют эффекты стресса, однако направленность воздействия зависит как от вводимой дозы, так и наличия дополнительного активационного стимула. Наиболее выраженный модулирующий эффект на фоне стресса оказывал β-эндорфин в низкой дозе (0.0005 мкг/кг), сопоставимой с физиологическими концентрациями β-эндорфина при стрессе. С определенной долей уверенности можно утверждать, что в общем β-эндорфин и динорфин А действуют на функциональную активность перитонеальных макрофагов однонаправленно – продукцию кислородных радикалов опиоидные пептиды стимулируют (β-эндорфин несколько сильнее), а секрецию цитокинов как про- (IL-1β), так и противовоспалительных (IL-10), преимущественно угнетают, несмотря на то, что взаимодействуют с различными типами опиатных рецепторов и оказывают эффекты различной направленности на поведение и эмоциональное состояние [Bali, Randhawa, Jaggi, 2016]. Исключением является физиологическая доза β-эндорфина 0.0005 мкг/кг, которая оказывала стимулирующий эффект на продукцию IL-10, что может объясняться особенностями взаимодействия пептида с µ, δ - опиоидными рецепторами [Smith, 2008], а также регуляцией β-эндорфином секреции гормонов гипоталамо-гипофизарной оси при стрессе [O`Connor, O`Halloran, Shanahan, 2000; Bilkei-Gorzo et al., 2008]. Все опиоидные пептиды перекрестно взаимодействуют с различными типами опиатных рецепторов, с той лишь разницей, что эндогенные опиоиды имеют повышенную аффинность к определенному типу рецептора, а синтетические агонисты связываются в большей степени беспорядочно [Wu et al., 2012]. Ранее нами было показано, что данная доза стимулирует антителогенез, пролиферацию и продукцию IL-4 у мышей [Гейн и др., 2011]. При развитии общего адаптационного синдрома β-эндорфин и динорфин А оказывают тормозящее действие на гипоталамо-гипофизарную ось, угнетая секрецию КРФ в гипоталамусе через налоксонзависимый механизм [O`Connor, O`Halloran, Shanahan, 2000]. Кроме того, β-эндорфин и динорфин А могут оказывать прямое действие на кору надпочечников, и направленность их эффектов зависит от экспрессии того или иного типа рецептора. Показано, что у животных, дефицитных по β-эндорфину, увеличено содержание АКТГ и кортикостерона в ответ на липополисахарид [Refojo et al., 2002]. У нокаутированных по β-эндорфину и динорфину мышей пик секреции кортикостерона при стрессе снижался, но более выра-женно у животных, нокаутированных по β-эндорфину [Bilkei-Gorzo et al., 2008]. У нестресси-рованных животных, по нашим данным, β-эндорфин в широком диапазоне доз на уровень кортикостерона в плазме крови влияния не оказывает [Баева, Гейн, 2018].

Работа выполнена в рамках государственного задания, номер государственной регистрации темы № 01201353248.