Определение биохимических признаков микробиологических культур, входящих в состав консорциума SCOBY

В настоящее время растет интерес к ферментированным функциональным продуктам. Преимуществом процессов ферментации является то, что при их проведении повышается ценность неиспользуемых растительных отходов, безопасность, поскольку процессы являются естественным и не предусматривают применение биологически опасных загрязнителей и экономичность процессов.

Известны исследования по технологии ферментации сахарозы, чайных листьев, а также другого сырья (злаки или листья растений, фруктовые выжимки, соки, кокосовая вода) или продуктов животного происхождения (молоко, сыворотка) [1].

Эта ферментация осуществляется характерным консорциумом дрожжей и бактерий под названием SCOBY (симбиотическая культура бактерий и дрожжей) [2, 3]. В то время как дрожжи сбраживают сахара и выделяют этанол, бактерии окисляют спирт и производят кислоты.

В данном консорциуме уксусные бактерии удерживаются на поверхности, используя продукты жизнедеятельности дрожжей Saccharomyces, расположенных в нижней части пленки и осуществляющих анаэробное брожение.

Микробиологический состав консорциума может варьироваться в зависимости от таких факторов, как климат, географическое положение и среда, используемая для процесса ферментации [3, 4].

Среди уксусных бактерий, входящих в состав консорциума, следует выделить Acetobacter xylinum , поскольку целлюлоза, из которой состоит SCOBY, синтезируется им [5].

Действие A. xylinum начинается с окисления глюкозы до глюконовой кислоты. Другой специфический метаболизм приводит к микробному синтезу целлюлозы, образуя биопленку, которая остается на поверхности жидкости.

Процесс включает синтез уридин-дифосфат-глюкозы (UDPGlc), который является предшественником целлюлозы, так что каждая клетка Acetobacter может полимеризовать до 200000 остатков глюкозы в секунду в цепях в-1,4-глюкана. Преимущество этой формы производства целлюлозы заключается в том, что бактерии размножаются в контролируемых условиях и могут производить целлюлозу из различных источников углерода, включая глюкозу, этанол, сахарозу и глицерин [2].

Бактерии, которые преобладают в консорциуме SCOBY, являются продуцентами уксусной и глюконовой кислот, принадлежащих к роду Acetobacter и Gluconobacter. Acetobacter xylinum реклассифицированая как Gluconacetobacter xylinus, помимо продуцирования уксусной и глюконовой кислоты также производит целлюлозу, важный компонент для целлюлозной пленки [2].

Gluconacetobacter sp. A4 также примечателен производством D-сахариновой-1,4-лактоновой кислоты (DSL), компонента, полученного из D-глюкаровой кислоты, ответственного за предотвращение образования токсичных соединений в печени [5].

Из консорциума SCOBY выделены дрожжи родов Koleckera, Mycotorula, Mycoderma, Saccharomyces, Schizosaccharomyces и Zygosaccharomyces [2-4].

Watawana и соавторы выделили Zygosaccharomyces как преобладающие дрожжи с относительной численностью 84,1% у видов SCOBY, и Dekkera и Pichia с 6 % и 5 % соответственно [6].

Органические остатки, используемые в процессе ферментации, вызывают снижение pH субстрата, что приводит к нехватке кислорода из-за повышения кислотности. Таким образом подавляется возможный рост патогенных бактерий, что гарантирует безопасность продукта [6].

Объекты и методы исследований. Так как микробиологический состав консорциума бактерий и дрожжей может варьироваться в зависимости от таких факторов, как климат, географическое положение и среда, используемая для процесса ферментации, для лабораторных исследований были отобраны 4 консорциума SCOBY, распространенные в Краснодарском крае.

Объектами являлись чистые культуры дрожжей Zygosaccharomyces kombuchaensis        и        бактерий

Gluconacetobacter xylinus , составляющие симбиотическую культуру под названием SCOBY (symbiotic culture of bacreties and yeasts), адаптированные и культивируемые в Краснодарском крае.

Были проведены исследования с дрожжевыми клетками, на выяснение устойчивости к кислотам, высокой устойчивости на повышенное осмотическое давление, вызванное высокими концентрациями сахара или соли, а также способность активно сбраживать сахара, особенно фруктозы. Была выявлена важная характеристика для дрожжевых клеток, входящих в консорциум SCOBY – высокая толерантность к этанолу.

Обсуждение результатов. Дрожжевые штаммы относятся к биологическому виду Zygosaccharomyces kombuchaensis , если они обладают следующими признаками:

• 1.    Сбраживают сахарозу, глюкозу, фруктозу.

• 2.    Ассимилируют этанол.

• 3.    Растут при +35 °С.

• 4.    Не растут на среде с 0,1 % содержанием антибиотика.

Бактериальные штаммы относятся к виду Gluconacetobacter xylinus , если они обладают следующими признаками:

• 1.    Образуют целлюлозную массу.

• 2.    Не образуют коричневый пигмент на среде глюкоза/дрожжевой экстракт.

• 3.    Производят уксусную кислоту.

• 4.    Растут в присутствии 0,35 % уксусной кислоты.

Для дальнейших исследований представляло интерес определить наилучшие виды микроорганизмов, обладающие всеми признаками.

Для этого из четырех культур SCOBY были дифференцированы составляющие их бактерии и дрожжи. Каждая культура была пронумерована исходя из того, из какого консорциума была выделена.

Результаты по дифференциации исследуемых микроорганизмов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Идентификация изучаемых штаммов по основным физиологическим при- знакам

№ п/п

Культура

Изучаемые признаки

8 X cd О 2 cd ca s kO U

8 2 2 cd ca s U

8 2 ca s kO U

CD 2 & те S о о

О + В & В о

cd О те: & о В

в те 2 В" 2 & О

о cd cd о в О с

2 в о са

ID О В Н НН В X Д 5К

1

Zygosaccharomyces kombuchaensis

+

+

+

+

+

-

–

2

Zygosaccharomyces kombuchaensis

±

±

±

±

±

-

3

Zygosaccharomyces kombuchaensis

±

-

±

±

с

-

4

Zygosaccharomyces kombuchaensis

±

-

±

±

с

с

1

Gluconacetobacter xylinus

±

-

+

±

2

Gluconacetobacter xylinus

±

±

±

-

3

Gluconacetobacter xylinus

+

-

+

+

4

Gluconacetobacter xylinus

±

-

±

с

Примечание: «+» – активный рост; «±» – менее активный рост; «с» – рост только на 5-6 сутки; «-» – рост полностью отсутствует

Как видно из таблицы 1, наилучшими характеристиками из дрожжей обладает Zygosaccharomyces kombuchaensis № 1, так как остальные культуры недостаточно быстро сбраживают сахара, № 2 и № 3 не сбраживают глюкозу, № 3 и № 4 показали замедленный рост при температуре + 35° С, № 4 показал наличие роста на среде с антибиотиком, что является недопустимым.

Zygosaccharomyces kombuchaensis № 1 активно сбраживают сахарозу, глюкозу и фруктозу, при этом ассимилируют этанол, растут при +35° С и не растут на среде с 0,1 % антибиотиком.

Наилучшими характеристиками из бактерий обладает Gluconacetobacter xylinus № 3, так как остальные культуры бактерий недостаточно активно производят целлюлозную массу, № 2 показал образование коричневого пигмента и отсутствие роста на среде в присутствии 0,35 % уксусной кислоты, № 1 и № 4 показали недостаточно быстрый и слабый рост на среде в присутствии 0,35 % уксусной кислоты. Это свидетельствует о том, что во время процесса брожения дрожжей, данные культуры не смогут перерабатывать этанол в уксусную кислоту в эквивалентном количестве, что является недопустимым.

Gluconacetobacter xylinus № 3 в свою очередь активно производят целлюлозную массу и уксусную кислоту, при этом показывают рост в присутствии 0,35 % уксусной кислоты и не образуют в процессе жизнедеятельности коричневый пигмент на среде глюкоза/дрожжевой экстракт.

Учет результатов проводился через 3-е суток, а затем еще через неделю. Иногда дрожжи медленно адаптируются к некоторым источникам углерода и, поэтому, окончательный просмотр чашек проводился еще через 3 недели.

Выводы. Таким образом, по результатам тестов можно сделать вывод: Zygosaccharomyces kombuchaensis № 1 и Gluconacetobacter xylinus № 3 являются наилучшими культурами для дальнейшего исследования и получения консорциума. Так же в ходе проведения исследований нами было замечено, что дрожжи Zygosaccharomyces проявляют фрукто-фильное поведение, потребляя фруктозу быстрее, чем глюкозу, когда в среде присутствуют оба источника углерода. Следовательно, скорость роста дрожжей значи- тельно ускоряется в пищевых продуктах, содержащих более 1 % фруктозы, и производство этанола происходит с большей скоростью и с более высоким выходом в присутствии фруктозы.