Определение циклоспорина А в сыворотке крови для терапевтического лекарственного мониторинга

Для терапевтического лекарственного мониторинга циклоспорина А в клинической практике традиционно используют иммунологические методы. Метод ВЭЖХ также используют для определения циклоспорина А, но его активное применение в рутинной клинической практике ограничено по многим причинам, в том числе и из-за отсутствия удобных и экономичных методик анализа. В связи с низкой терапевтической концентрацией циклоспорина А в сыворотке крови (100– 400 нг/мл) в качестве детектора при ВЭЖХ-определении обычно используют ESI-MC [1] или ESI-MC-МС [2], что позволяет существенно повысить чувствительность определения и надежность идентификации определяемого компонента, но высокая стоимость этого оборудования делает экономически невыгодным применение МС-детектора в рутинном анализе.

При определении циклоспорина А методом ВЭЖХ с УФ-детектированием при использовании стандартного аналитического оборудования требуется концентрирование из большого объема сыворотки (1 мл) и введение внутреннего стандарта.

В связи с этим целью нашей работы явилась оптимизация существующих ВЭЖХ-методов определения циклоспорина А и создание методики, пригодной для серийного рутинного анализа.

Циклоспорин А — циклический пептид, состоящий из 11 аминокислот (рис. 1). В качестве подготовки пробы для извлечения циклоспорина А из сыворотки крови обычно используют либо жидко-жидкостную [3, 4], либо твердофазную экстракцию [2, 5] с последующим МС- реже УФ-детектированием [3–7].

Хроматографическое определение на обращен- ной фазе выполняют в двух- или трехкомпонентных подвижных фазах, состоящих из ацетонитрила, метанола и воды или буфера в режиме изокра-тического элюирования [3–7]. Температура хроматографической колонки в процессе определения варьируется от комнатной [5] до 70-80 °С [2-4, 6] и зависит от емкости используемого сорбента.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали циклоспорин А в виде фармацевтической субстанции ("Novartis"), ацетонитрил для ВЭЖХ ("Криохром", Санкт-Петербург, Россия), хлористый метилен, гексан, перхлорат лития и муравьиную кислоту — квалификация не ниже х. ч.

Хроматографический анализ выполняли на жидкостном хроматографе Милихром А02 (ЗАО "ЭкоНова", Новосибирск, Россия). Колонка 0 2 х 75 мм с Nucleosil 100-5 C18 ("Macherey-Nagel", Duren, Germany). Температура колонки 70 ° С. Элюент A: 0.2 M LiClO 4 —H 3 PO 4 , pH 3; элюент Б: МеCN. Градиент: линейный, 2500 мкл от 50 % Б до 80 % Б, 1000 мкл 80 % Б. Скорость потока 150 мкл/мин. Детектирование на длинах волн 200, 204, 210 и 214 нм. Объем пробы 50 мкл.

Масс-спектрометрическое детектирование проводили на приборе МХ-5310, оборудованном источником ионизации "электроспрей" (electrospray ionization, ESI) с ортогональным вводом ионов и времяпролетным масс-анализатором (TOF) (ESI– TOF), (ИАнП РАН, Санкт-Петербург, Россия). Запись спектра вели в режиме детектирования положительных ионов. При проведении масс-спектрометрического эксперимента в качестве подвижных фаз использовали: элюент А — 0.5 % НСООН

MeLeu9

H 3 C

H 3 C

MeLeu10

CH 3 CH 3

CH

_H  CH 2

MeVal11

CH 3 CH 3

CH 3 H

C

II

C

H CH 2

MeBmt1

C H

Abu2

CH 3

\ HO

_H^CH_CH3 H CH CH₃H _? CH 2

Sar 3

CH 3

H 3 CN CCONCCNCCO NCC NCH

CO H

CH 3

CH CH2INC

w

O

H

CH 3

H

O

O

H

I 2

CO

N CH

CH NCO C N CO C N C C NC CNCO C

³            H i _O

CH 3 H     H CH₃^OH CH 2 H CH H

³            CH 3 CH 3

CH 2

D-Ala 8

CH

1 3

CH

Ala7

CH 3 CH 3

Val5

CH 3 CH 3

MeLeu6

MeLeu4

Рис. 1. Структурная формула циклоспорина А в воде (pH 2.5), элюент Б — 0.5 % НСООН в ацетонитриле. Градиент линейный, 2500 мкл от 50 % Б до 80 % Б, 1000 мкл 80 % Б.

Для проведения анализа к 600 мкл сыворотки крови добавляли 600 мкл ацетонитрила для осаждения белков сыворотки и центрифугировали. 1000 мкл супернатанта переносили в другую пробирку и добавляли 1000 мкл хлористого метилена. После экстракции (5 мин) и расслоения фаз водный слой отбрасывали, а органический переносили в чистую пробирку и упаривали досуха в токе аргона. Сухой остаток, содержащий циклоспорин А, перерастворяли в 70 мкл 50 %-го водного ацетонитрила, содержащего 1 % муравьиной кислоты, добавляли 0.5 мл гексана и встряхивали 5 мин. После разделения слоев нижний слой переносили в пробирку для автосамплера и хроматографировали.

Идентификацию пика циклоспорина А на хроматограмме экстракта сыворотки крови выполняли по времени удерживания, спектральным отношениям и данным МС. Концентрацию циклоспорина А в исходной сыворотке рассчитывали по градуировочной зависимости, полученной на основе градуировочных растворов. Градуировочные растворы готовили путем добавления стандартного раствора циклоспорина А к донорской сыворотке. Далее пробы обрабатывали в соответствии с прописью методики. Градуировочная зависимость для циклоспорина А получена для 5 концентраций в интервале 50–400 нг/мл (в пересчете на исходную сыворотку, n = 5) Погрешность определения не превышала 15 % в интервале терапевтических концентраций (100–400 нг/мл).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе предложена микроколо-ночная ВЭЖХ-методика для определения циклоспорина А в сыворотке крови пациентов. Обработка образца гексаном перед его введением в хроматограф позволяет устранить мешающее влияние УФ-поглощающих гидрофобных компонентов матрицы, применение микроколоночного варианта ВЭЖХ определяет экономичность методики, а многоволновое спектрофотометрическое детектирование повышает надежность идентификации циклоспорина А.

Обычно высокогидрофобные соединения, содержащиеся в необработанной сыворотке крови, сорбируются на обращенной фазе С 18, значительно сокращая время эксплуатации хроматографической колонки. Полное удаление таких веществ из колонки возможно только при введении в состав подвижной фазы таких растворителей, как

0.8

0.6

0.4

0.2

а

A 200

0     8    16

Время, мин

0     8

Рис. 2. Хроматограммы сыворотки крови при различных способах обработки пробы.

а — без обработки гексаном; б — после экстракции гексаном, рН 7; в — после экстракции гексаном, рН 2.5

Рис. 3. Хроматограмма экстракта сыворотки крови пациента, принимающего лечение циклоспорином А (200 мг/сутки). Концентрация циклоспорина А в исходной сыворотке составляет 98 ± 10 нг/мл.

1 — циклоспорин А ацетон, гексан, хлороформ, что, как правило, неудобно, особенно при масс-спектрометрическом детектировании. Предварительная обработка пробы гексаном позволяет удалить часть таких соединений. Нами показано, что гексан извлекает из 1 мл сыворотки крови в нейтральной среде (сыворотка : гексан = 1 : 5; рНсыв.≈ 7) от 0.8 до 1.2 мг липидов, что составляет 10–20 % от их общего количества. Гексан является неденатурирующим довольно слабым экстрагентом и поэтому в данных условиях извлекает только свободные и слабосвязанные нейтральные гидрофобные соединения.

Значения спектральных отношений циклоспорина А

Спектральные отношения, R	Циклоспорин А (проба)	Циклоспорин А (стандарт)
S 204 /S 200	0.918	0.938
S 210 /S 200	0.626	0.658
S 214 /S 200	0.520	0.566

Более полное извлечение возможно при экстракции гексаном из кислой среды (рН 2.5) после осаждения белков ацетонитрилом (рис. 2). Этот прием был нами использован при определении циклоспорина А в сыворотке крови. Регистрируемый при этом пик циклоспорина А (рис. 3) симметричен, несмотря на большой объем инжектируемой пробы (растворитель — 50 %-й ацетонитрил), и полностью отделен от сопутствующих компонентов.

При УФ-ВЭЖХ-определении циклоспорина А для повышения надежности идентификации обычно используют метод внутреннего стандарта [3, 4, 7]. К недостаткам этого приема при определении циклоспорина А можно отнести коммерческую недоступность предлагаемых стандартных соединений. Многоволновая фотометрическая детекция позволяет ввести дополнительные параметры для идентификации определяемого соединения и, таким образом, отказаться от необходимости использования внутреннего стандарта. В таблице приведены спектральные отношения, рассчитанные как отношение площадей пиков, зарегистрированных при длинах волн λ _х и λ ₂₀₀. Совпадение в пределах ошибки ( ± 0.05) спектральных отношений и времени удерживания пика циклоспорина А в экстракте сыворотки крови со спектральными отношениями и временем удерживания пика стандартного раствора свидетельствуют об идентичности и гомогенности пика определяемого соединения. Для подтверждения надежности определения на стадии разработки методики идентификацию пика циклоспорина А в экстрактах сыворотки крови проводили с использованием масс-спектрометрического детектирования методом ESI-TOF в режиме "on-line" (рис. 4).

Применение короткой колонки по сравнению с традиционной аналитической колонкой ∅ 4.6 × 250 мм позволяет в 10–20 раз снизить расход растворителей и во столько же раз повысить чувствительность определения. Кроме этого, режим градиентного элюирования позволяет еще вдвое снизить предел определения циклоспорина А.

Рис. 4. Идентификация пика циклоспорина А в экстрактах сыворотки крови методом хромато-масс-спектрометрии.

А — масс-спектр, соответствующий хроматографическому пику А

Разработанная методика апробирована в клинической практике онкогематологического отделения Иркутской государственной областной детской больницы. В соответствии с Международным протоколом IPH-93-APL 2 (версия 1996) "Комбинированная иммуносупрессивная терапия приобретенных апластических анемий" при лечении требуется мониторирование циклоспорина А, концентрация которого в крови ребенка должна находиться в интервале 150–300 нг/мл.

Для определения минимальной концентрации циклоспорина А кровь из локтевой вены отбирали за 1–2 ч до утреннего приема препарата. Методика оказалась эффективна при коррекции доз циклоспорина А в процессе лечения.