Определение эссенциальных и токсичных элементов в моче методом ICP-MS для диагностических исследований и оценки рисков здоровью населения

но прямые методы определения токсичных соединений и элементов в биологических средах человека являются неоспоримым доказательством неблагоприятного техногенного воздействия, а в совокупности с маркерами эффекта – причиненного вреда здоровью [7, 15].

В настоящее время для высокоточных и селективных определений большого спектра элементов используется метод масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-MS). Сочетание таких характеристик, как низкие пределы обнаружения, высокая воспроизводимость, широкий диапазон определяемых концентраций, низкий расход анализируемых веществ и возможность выполнения анализа с минимальным объемом, обеспечивает высокую информативность метода для определения микро- и ультрамикросодержаний в биологических жидкостях [12].

С точки зрения доступности наиболее распространенным неинвазивным объектом исследования биологических сред человека является моча. В то же время основной проблемой при определении элементов в моче является высокое содержание солей – хлоридов, сульфатов, фосфатов, которое значительно повышает матричное влияние и ведет к завышению результатов анализа за счет интерференционных помех [6, 8, 11].

Цель данного исследования – разработка высокочувствительного и точного метода количественного определения V, Cr, Mn, Ni, Сu, Zn, As, Se, Sr, Cd, Tl, Pb в моче как маркеров экспозиции в условиях воздействия химических факторов среды обитания.

Материалы и методы. Количественное определение V, Cr, Mn, Ni, Сu, Zn, Se, Sr, Cd, Tl, Pb в образцах мочи осуществляли на квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно-связанной плазмой Agilent 7500cx (USA) с октопольной реакционно/столк-новительной ячейкой (ORS). Использование ORS позволяет избавиться от влияния поли-атомных ионов за счет их столкновений или реакций с атомами газа, заполняющими ячейку. В качестве газа ячейки использовали гелий. Экспериментально было установлено значение скорости потока гелия 5,0 мл/мин, позволяющее значительно снизить поли-атомные наложения при сохранении высокого уровня чувствительности. Мощность высокочастотного сигнала 1550 Вт. Для введения проб использовалась двухканальная распылительная камера Скотта. Температура распылительной камеры 2,0 °С. Скорость подачи образца в распылительную камеру составляла 0,4 мл/мин. Скорость работы детектора – ≥ 100 мкс на 1 ион. В качестве газа-реактанта использовался гелий. Для настройки применяли раствор 7Li, 59Co, 89Y и 205Tl в 2 % HNO3 с концентрацией 1 мкг/л для каждого элемента (Tuning Solution, USA). Соотношения 140Ce16O+/140Ce+ + составляли < 1 %, а для 140Ce2+/140Ce+ + < 3 %. Использовали жидкий аргон высокой чистоты 99,99 % (ТУ-2114-005-00204760-99). Максимальная скорость потока аргона составляла 20 л/мин, давление в канале подводки газа 700±20 кПа, Тплаз-мы = 8000–10000 К. Автоматизация процесса проведения анализа обеспечивалась автосэмплером марки G3160B (Germany). В качестве основного стандартного раствора использовали раствор, содержащий 27 элементов с концентрацией 10 мг/л в 5 % водном растворе HNO3 (Multi-Element Calibration Standard-2A, USA). Для приготовления градуировочных растворов и подготовки проб использовали особо чистую HNO3 (Sigma – Aldrich, USA). Концентрации градуировочных растворов для определения Cd и Tl составляли 0,0; 0,1; 0,5; 1,0 мкг/л, для Mn, Ni, Cr, V, Se, Cu – 0,0; 0,1; 0,5; 1,0; 5,0 мкг/л, для As, Sr, Zn – 0,0; 1,0; 5,0; 10,0; 50,0 мкг/л соответственно. Для приготовления растворов внутреннего стандарта (ВС) использовали комплексный стандартный раствор 209Bi, 73Ge, 115 In, 6Li, 45Sc, 159Tb, 89 Yс с концентрацией 10 мг/л в 5 % водном растворе HNO3 (Internal Standard Mix, USA). В качестве внутреннего стандарта для определения Pb и Tl применяли 159Tb, при определении Cd – 115 In, а для остальных элементов – 72Ge, вследствие близости потенциалов ионизации и атомной массы.

Все растворы разбавляли деионизированной водой с удельным сопротивлением 18,2 Mом∙см, очищенной в системе Milli-Q Integral (Millipore SAS, France). Холостую пробу готовили аналогично рабочей. Для подготовки к анализу лабораторной посуды из стекла, тефлона, полипропилена использовали ультразвуковую мойку Elmasonic S 100H (Germany). Посуду выдерживали 20 мин в бидистиллированной воде при 55 °С, далее 20 мин в водном растворе азотной кислоты (1:5) при 55 °С, далее 20 мин в деионизованной воде при 55 °С.

Стандартные образцы мочи SeronormTM urine (LOT 0511545, Sero AS, Billingstad, Norway) разбавляли в 5 мл деионизированной воды.

Отбор проб утренней мочи производили в стерильные полипропиленовые контейнеры на 125 мл с винтовой крышкой (F.L.Medical S.r.l., Torreglia, Italy). Для последующего масс-спектрометрического исследования к 0,5 мл мочи добавляли 4,45 мл

1 % водного раствора HNO 3 и 0,05 мл раствора внутреннего стандарта.

Результаты и их обсуждение. Разработанная методика определения 12 элементов в моче методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой отличается от действующих в настоящее время МУК 4.1.1483-03 [10] отработанной схемой про-боподготовки для минимизации матричных эффектов, выбором внутреннего стандарта для каждого определяемого элемента, использованием столкновительной ячейки с гелием для коррекции полиатомных интерференций. Методика аттестована центром «Сертимет» (№ 88-16374-102-01.00076) и зарегистрирована в Федеральном информационном фонде по обеспечению единства измерений ФР.1.31.2014.17064.

Диапазоны измерений массовых концентраций V, Cr, Mn, Ni, Сu, Zn, As, Se, Sr, Cd, Tl, Pb и предел обнаружения (LOD) приведены в табл. 1.

Таблица 1

Диапазоны измерений в моче и пределы обнаружения в растворе, мкг/дм3

Наименование определяемого элемента	Массы изотопов, используемых при измерении	Диапазон измерений в моче, мкг/дм3	Показатель точности (границы относительной погрешности при Р = 0,95), ± δ , %	Предел обнаружения (LOD)в растворе, мкг/дм3
Ванадий	51	0,1–50,0	15–23	0,01
Хром	53	0,1–100,0	14–23	0,01
Марганец	55	0,1–100,0	14–25	0,01
Никель	60	0,1–100,0	15–22	0,01
Медь	63	1,0–200,0	14–20	0,1
Цинк	66	50,0–1000	13	5
Мышьяк	75	1,0–100,0	14	0,1
Селен	82	5,0–500,0	16	0,5
Стронций	88	50,0–1500	12	5
Кадмий	111	0,1–50,0	16–23	0,01
Таллий	205	0,1–50,0	15–19	0,01
Свинец	206	0,1–500,0	15–23	0,01

Правильность результатов определения 12 элементов в моче подтверждена анализом стандартных образцах мочи Seronorm^TM urine ( n = 5, рисунок).

Обобщенные результаты исследований анализа стандартных образцов мочи, полученные с использованием разработанного метода, показывают, что погрешность при определении всех элементов составляет от 2 до 5 %.

Разработанная методика определения была отработана на территориях Пермского края с минимальной антропогенной нагрузкой и позволила получить результаты, представленные в табл. 2.

Минимальный уровень аттестованного значения

Максимальный уровень аттестованного значения

Экспериментально найденные значения

Рис. Результаты определения микроэлементов относительно сертифицированных значений в образцах SeronormTM urine

Таблица 2

Фоновые уровни содержания элементов в моче детского населения Пермского края, полученные методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP–MS), мкг/дм3

Определяемый элемент	Фоновые уровни ( n = 73), M ± m , мкг/дм3	Референтные уровни, мкг/дм3, по Тицу [11]
Марганец	0,93±0,3	0,5–10,0
Мышьяк	13,0±2,5	5,0–50,0
Никель	2,2±0,56	0,1–10,0
Свинец	1,2±0,17	< 80,0
Стронций	166,0±26,0	20,0–350,0 [10]
Хром	1,4±0,13	0,1–2,0
Медь	12,0±2,0	2,0–80,0
Цинк	240,0±40,0	180,0–850,0
Кадмий	0,2±0,2	0,5–4,7
Ванадий	0,6±0,1	0,08–0,24

На основании выполненных исследований образцов мочи детского населения можно заключить, что разработанная методика позволяет получать достоверные данные, сопоставимые с референтными концентрациями, используемыми в качестве критериаль- ных оценочных величин в клинических исследованиях и доказательной медицине.

Выводы. Таким образом, отработанная схема подготовки образцов, оптимальные элементы внутреннего сравнения, отработанный комплекс инструментальных на- строек масс-спектрометра с индуктивносвязанной плазмой, в том числе октополь-ной реакционно/столкновительной ячейкой, позволили минимизировать матричное и интерференционное влияния солевого состава мочи на этапе пробоподготовки.

Разработанная методика позволяет точно и достоверно определять V, Cr, Mn, Ni, Сu, Zn, As, Se, Sr, Cd, Tl, Pb в образцах мочи, предел определения для V, Cr, Mn, Ni, Sr, Cd, Tl, Pb составляет 0,1 мкг/дм3, для Сu – 1,0 мкг/дм3, для Se – 5,0 мкг/дм3, для

Sr и Zn – 50,0 мкг/дм3 с погрешностью определения, не превышающей 25 %.

Исследования мочи детского населения Пермского края, проживающего в экологически благополучных условиях, выполненные разработанным методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой, позволили установить фоновые уровни содержания V, Cr, Mn, Ni, Сu, Zn, As, Se, Sr, Cd, Tl, Pb в моче как критерии сравнения для задач гигиенических оценок, эпидемиологических исследований, обследований, экспертиз.