Определение лекарственных препаратов в биожидкостях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

E-mail: sme@sibsme.ru

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В БИОЖИДКОСТЯХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Новосибирское областное бюро судебномедицинской экспертизы ГУ НГМУ

В связи с увеличением в последнее время числа острых и смертельных отравлений различными лекарственными препаратами все более актуальным становится вопрос химико-токсикологических и судебно-химических исследований по идентификации лекарственных препаратов и определения их концентраций в биологических средах. Также важное значение в химико-токсикологическом анализе занимает вопрос мониторинга лекарственных препаратов в крови, поскольку с этим связан выбор метода лечения пациентов. В связи с этим с каждым годом растут требования, предъявляемые к судебно-химическим исследованиям, поскольку расширяется список определяемых препаратов, увеличивается число отравлений комбинацией двух и нескольких лекарственных препаратов, повышаются требования к чувствительности методик, к избирательности. Все это требует разработки новых методик анализа, основывающихся на современных инструментальных методах исследования.

Химико-токсикологический и судебно-химический анализ различных лекарственных препаратов в биологических средах представляет значительные трудности в связи с существенными различиями как самих биологических матриц, так и анализируемых лекарственных препаратов. Кроме того, важно учитывать метаболизм лекарственных препаратов.

Химическое исследование лекарственных препаратов в биологических средах включает несколько последовательных стадий: стадии извлечения лекарственного препарата из биологического объекта, стадии очистки от соэкстрактивных веществ, стадии концентрирования и стадии анализа. Традиционно для извлечения лекарственных препаратов из биологических объектов используют жидкость-жид-костную экстракцию раздельно для веществ кислого и основного характера, и основным методом исследования остается метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). Как уже отмечалось, с каждым годом растет перечень лекарственных препаратов в химико-токсикологической экспертизе, и определение лекарственного препарата в биологических объектах становится все более сложной задачей. Используемый в настоящее время метод ТСХ имеет ряд недостатков: данный метод неспецифичен, поскольку идентификация неизвестного лекарственного препарата этим методом часто неоднозначна (а иногда невозможна) из-за совпадения параметров нескольких лекарственных препаратов, не дает количественной оценки вещества и требует затрат большого количества реактивов и времени.

В настоящее время все более широко внедряются инструментальные методы анализа, обладающие высокой чувствительностью и избирательностью: газовая хроматография с масс-селективным детектором (ГХ/МСД), высокоэффективная жидкостная хроматография с многоволновым детектированием (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез (КЭ). Все эти методы можно также использовать в скрининговом варианте.

Известны варианты скрининга методом ТСХ и УФ-СФМ, методом ТСХ и ГХ/МСД, есть варианты методом ВЭЖХ. Метод ГХ/МСД требует дорогостоящего оборудования, дополнительной пробопод-готовки для перевода лекарственных препаратов в более летучие соединения и расхода дорогостоящих реактивов. Несомненным достоинством метода ГХ/ МСД является наличие библиотеки (базы данных) лекарственных, наркотических препаратов и их метаболитов. Методы ВЭЖХ и КЭ отличаются простотой, небольшими трудозатратами, малым расходом реактивов, но не имеют библиотек, подобных ГХ/ МСД, которые необходимо создавать самостоятельно в процессе работы.

В качестве основного метода идентификации лекарственных препаратов и определения их количественного содержания нами в судебно-химическом отделении Областного Бюро судебно-медицинской экспертизы (г. Новосибирск) с 2001 г. используется метод ВЭЖХ на хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», г. Новосибирск), колонка 2х75 мм с термостатированием, с обращено-фазовым сорбентом Prontosil120—5 С18, многоволновым УФ-детектором. Условия ВЭЖХ анализа: элюенты: 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты в дистиллированной воде (элюент А) и 0,1%-ный раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле (элюент В); анализ в режиме градиента элюента В; скорость потока 150 мкл/мин; рабочие длины волн детектора 220, 230, 240, 250, 270, 280 nm, базовая – 210 nm. Объем пробы можно варьировать от 1 до 100 мкл. Идентификация веществ проводится по временам удерживания и спектральным отношениям с использованием созданной нами библиотеки, включающей более 250 лекарственных препаратов.

Для идентификации и количественного определения лекарственных препаратов при исследовании методом ВЭЖХ (в том числе и для исследования в режиме скрининга) нами отбирались пробы по 0,6 мл из хлороформных экстрактов из биообъектов для определения веществ кислого и основного ха-51

рактера, приготовленных по методике А.А. Васильевой. Пробы из обоих экстрактов (вещества кислого и основного характера) объединяют, высушивают при комнатной температуре, сухой остаток растворяют в 2%-ном растворе ацетонитрила в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты и исследуют методом ВЭЖХ. Таким образом, в одной пробе определяются вещества кислого и основного характера. Количественное содержание лекарственных препаратов определяют по калибровочным графикам, построенным по серии разведений стандартных веществ методом абсолютной калибровки с использованием программного комплекса «Мультихром».

Для идентификации лекарственного препарата исследуются в первую очередь экстракты из мочи и желчи, поскольку, как правило, в этих объектах лекарственные препараты присутствуют в высоких концентрациях. Для количественного определения исследуем экстракты из крови, поскольку только для крови имеются данные по терапевтическим, токсическим и летальным дозам. Жидкость-жидкост-ная экстракция в делительных воронках, применяемая в настоящее время, имеет ряд недостатков: необходим большой объем биожидкости (до 100 мл), большой расход реактивов, многостадийность, длительность (кровь при подкислении и подщелачивании образует с экстрагентами стойкую суспензию), неточность.

Поскольку для исследования методом ВЭЖХ необходимо всего 5-10 мкл пробы, нами исследована возможность проведения однократной экстракции лекарственных препаратов из одной пробы крови (мочи и желчи) объемом 0,6 мл в пробирках «Эп-пендорф».

Исследования проводили на модельных смесях биожидкостей с известным количеством лекарственных препаратов (смесь №1: азалептин + анапри-лин + фенобарбитал, смесь №2: донормил + имован + золпидем). Экстракцию проводили из 0,6 мл биожидкости. В качестве экстрагентов использовались хлороформ и смеси растворителей на основе хлороформа с изо-пропиловым спиртом, с ацетоном, с ацетонитрилом, с этилацетатом и другими растворителями. Установлено, что степень извлечения исследуемых лекарственных препаратов смесями хлороформа с ацетоном в соотношении 9:1 и хлороформа с ацетонитрилом в соотношении 9:1 выше в 1,5-2 раза, чем чистым хлороформом.

Предлагаемый нами метод опробован на реальных образцах крови, мочи и желчи при отравлениях лекарственными препаратами. При отравлениях в пробах крови, мочи и желчи были идентифицированы: азалептин, анаприлин, салициловая кислота, анальгин+церукал, фенобарбитал, анаприлин, анальгин+фенобарбитал, анаприлин+фенобарбитал, амитриптилин+фенобарбитал, амитриптилин, промедол, донормил, карбамазепин, антаксон и др. На рис. 1 представлены хроматограммы извлечений 52

Извлечение из желчи

Рис. 1. Хроматограммы извлечений из крови, мочи и желчи

Таблица

Результаты сравнительного исследования количественного содержания лекарственных препаратов, извлекаемых из биологических объектов по предлагаемому методу и методу А.А. Васильевой

Лекарственное вещество (биологическая жидкость) Количество извлеченного лекарственного вещества (в мкг/мл) по методу А.А. Васильевой по предлагаемому методу Азалептин (кровь) 0,01 0,54 Анаприлин (кровь) 0,21 3,44 Анаприлин (моча) 2,14 9,04 Салициловая кислота (кровь) 0,03 1,98 Салициловая кислота (моча) 3,78 15,08 Метопролол (кровь) 15,57 16,40 Изониазид (кровь) 1,08 15,74 Фенобарбитал (кровь) 0,32 5,84 из крови, мочи и желчи, полученных по предлагаемому нами методу при отравлении анаприлином. Определены концентрации анаприлина: в крови – 0,977 мкг/мл, в моче – 0,260 мкг/мл, в желчи – 6,182 мкг/мл.

Были проведены сравнительные исследования количественного содержания лекарственных препаратов, извлекаемых из биологических жидкостей по предлагаемому нами методу и методу А.А. Васильевой, результаты представлены в таблице. Нами экспериментально установлено, что степень извлечения лекарственных веществ из крови предлагаемым методом в среднем в 20-30 раз выше, чем по методу А.А. Васильевой.

Таким образом, полученные данные на примере модельных смесей на основе крови, мочи и желчи и реальных пробах показали, что для идентификации лекарственного препарата при отравлениях можно использовать предлагаемый нами метод однократной экстракции из 0,6 мл биологических жидкостей смесями растворителей: хлороформа с ацетоном и хлороформа с ацетонитрилом. Степень извлечения лекарственных веществ из крови предлагаемым методом в 20-30 выше, чем в извлечениях по методу А.А. Васильевой. Кроме того, данный метод позволяет количественно определять лекарственные препараты в биологических матрицах. Предлагаемый метод имеет ряд преимуществ: значительно снижает трудоемкость анализа, снижает стоимость анализа за счет уменьшения объемов используемых реактивов, сокращает случайные и систематические ошибки в процессе подготовки проб, избирателен и чувствителен.