Определение мутагенного потенциала противомигренозного лекарственного вещества Ру-31 в виде субстанции и готовой лекарственной формы в тестах in vitro и in vivo

Наиболее распространенной формой головной боли является мигрень, которой страдают около 15 % населения, для купирования ее приступов в настоящее время применяются препараты, частота эффективности которых не превышает 60–65 %. Актуальным является разработка и внедрение новых лекарственных препаратов, прошедших предварительный тестовый контроль на мутагенную активность, так как высокоэффективных профилактических средств этого заболевания на данный момент не существует. Исследование новых лекарственных средств, улучшающих мозговой кровоток при мигрени на генотоксичность является общепринятым и крайне важным этапом проверки по оценке безопасности для здоровья населения [1–3]. Определение генотоксичности новых лекарственных средств является неотъемлемым этапом доклинических исследований.

В результате предварительных исследований было получено соединение, производное 2-метоксифенила-имидазобензимидазола (РУ-31) с 5-НТ 2А -антагонистическим механизмом действия, обладающее противомигренозными свойствами и на основе фармацевтической субстанции (ФС) РУ-31 получена твердая пероральная лекарственная форма – «РУ-31, таблетки по 8 мг» (готовая лекарственная форма, ГЛФ), способная устранять серотониновое влияние на сосуды головного мозга, требующая проведение доклинических испытаний на мутагенную активность в тестах in vitro и in vivo, чему, собственно, и посвящена настоящая работа [4, 5].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Определить мутагенный потенциал проти-вомигренозного лекарственного вещества, улучшающего мозговой кровоток с 5-НТ 2 -антаго-нистическим действием, производного 2-мето-ксифенил-имидазобензимидазола в виде фармацевтической субстанции и готовой лекарственной формы (ФС и ГЛФ РУ-31) в тестах in vitro и in vivo .

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

В исследовании использовали субстанцию РУ-31 (партия 006, лабораторный регламент 2/17 от 13.07.2017), синтезированную в ФГАО ВО Южный Федеральный университет, гранулят таблетированной лекарственной формы соединения РУ-31 (опытный образец 001 от 09.01.2018, лабораторный регламент № 01962942-005-2017 от 01.09.2017 г.), произведенный в Пятигорском медико-фармацевтическом институте – филиале ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России.

Исследуя ФС РУ-31 на наличие генных мутаций в тесте in vitro (микропланшетный тест Эймса) [6], использовали набор Ames MPF^TM Penta I (Xenometrix, Швейцария), включавший те-стерные штаммы S. typhimurium (ТА98, ТА100, ТА1535 и ТА1537) и E. coli (wp2 [pKM101] и wp2 uvrA) как рекомендованные Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Индукция обратных мутаций по типу замены оснований на штаммах S. typhimurium происходила по паре GC, тогда как на штаммах E.coli – по паре AT, что позволяло детектировать мутагены, реализующие свой эффект путем окислительной модификации или за счет образования сшивок, а также мутагены гидразинового ряда. Набор штаммов бактерий, входящих в кит, соответствовал требованиям руководства по оценке химических соединений OECD 471.

Тестирование для получения истинного раствора проводили согласно условиям проведения исследования при изучении мутагенной активности. Образец (ФС РУ-31) изучали в 6 концентрациях (растворитель ДМСО непосредственно перед экспериментом) в разведениях 1 – 0,019531 мг/мл; 2 – 0,039063 мг/мл; 3 – 0,078125 мг/мл; 4 – 0,15625 мг/мл; 5 – 0,3125 мг/мл и 6 – 0,625 мг/мл; и позитивный контроль – мутаген согласно инструкции производителя набора; негативный контроль – растворитель (ДМСО) (Инструкция по применению Ames MPFTMPenta I тест Эймса в микропланшет-ном формате версия набора с полутвердыми стоками штаммов, Xenometrix, Швейцария, Версия

• 4.5_S, 2012, 37 с.). Для статистической обработки данных каждая концентрация исследовалась в трех повторах методом t-test Стьюдента (односторонний, непарный). Различия считались достоверными при уровне значимости p ≤ 0,05.

Этап исследования ГЛФ РУ-31 на индукцию хромосомных повреждений in vivo проводили с учетом хромосомных аберраций в клетках костного мозга белых беспородных крыс в количестве 60 животных обоего пола (питомник ООО «НПК Биотех», Московская область). Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29.08.2014 № 51 «Об утверждении СП 2.2.1.321814 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)».

Цитогенетическое исследование проводили в двух сериях эксперимента, однократное и курсовое введение исследуемого препарата. Для изучения специфической фармакологической активности выбирались половозрелые крысы как рекомендованные Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств и общепринятые для данного этапа доклинических исследований в количестве 60 штук, обоего пола. Количество животных, используемое в исследовании, было достаточным для полноценной оценки и интерпретации изучаемых эффектов и соответствовало рекомендациям, изложенным в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств. В первой серии экспериментов тестируемый образец (ГЛФ РУ-31) растворяли в дистиллированной воде непосредственно перед экспериментом и вводили внутрижелудочно однократно 20 самцам крыс, по 5 животных в терапевтической 10 мг/кг и 1/10 от LD50 – 93 мг/кг дозе. В качестве положительного контроля 5 самцам внутрибрюшинно вводили мутаген (циклофосфамид) в дозе 20 мг/кг. В качестве отрицательного контроля – 5 самцам внутрижелудочно вводили дистиллированную воду в объеме эквивалентном объему вводимой готовой лекарственной форме РУ-31. Во второй серии экспериментов сформировали 6 анализируемых групп для тестирования по 15 самцов и 15 самок белых беспородных крыс и вводили им внутрижелудочно в течение 5 суток в средней эффективной дозе по 10 мг/кг, ежедневно ГЛФ РУ-31. В качестве негативного контроля были использо- ваны по 5 самцов и самок с внутрижелудочным введением дистиллированной вводы в объеме эквивалентном объему вводимого ГЛФ РУ-31.

В качестве позитивного контроля были использованы 5 самцов и 5 самок, которым внутрибрюшинно вводили мутаген – циклофосфамид, пятикратно в дозировке 20 мг/кг. Эвтаназию проводили с помощью цервикальной дислокации у крыс, находящихся под хлоралгидратным наркозом, согласно правилам «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» ее осуществляли своевременно, без причинения страданий, в помещении, где не содержались другие животные, по окончании срока эксперимента. Во всех группах от каждого животного анализировали 100 метафазных пластинок, с хорошим разбросом хромосом (модальное число хромосом 40) без наложений хромосом. Учитывали долю клеток, содержащих аберрантные хромосомы, отмечали наличие в клетках одиночных или парных фрагментов, обменов, гепов и множественных повреждений. Все данные обрабатывались методом описательной статистики с использованием подходящих критериев парного или множественного сравнения данных соответствующих Гауссовскому распределению данных. Статистический анализ проводился с использованием Microsoft Excel 2010 с расчетом базовых статистических показателей. Все исследования были одобрены Региональным исследовательским этическим комитетом Волгоградской области, протокол № 2032-2017от 26.06.2017 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В процессе изучения мутагенной активности ФС РУ-31 в тесте in vitro микропланшетном тесте Эймса, при анализе среднего числа позитивных лунок для S. typhimurium штаммов – ТА98,ТА100, ТА1535 иТА1537 без активации и с активацией фракцией S9 увеличения числа ревертантных колоний по сравнению с негативным контролем выявлено не было. Кратность превышения числа ре-вертантов относительно нулевой линии была менее чем 2,0, что свидетельствовало об отсутствии мутагенного эффекта во всех изучаемых концентрациях для штаммов – ТА98, ТА100, ТА1535, ТА1537 без активации и с активацией фракцией S9. При анализе среднего числа позитивных лунок для комбинации штаммов E.coli (wp2 [pKM101] и uvrA) без активации и с активацией фракцией S9 увеличения числа ревертантных колоний по срав- нению с негативным контролем выявлено не было. Кратность превышения числа ревертантов относительно нулевой линии была менее чем 2,0, что свидетельствовало об отсутствии мутагенного эффекта во всех изучаемых концентрациях для комбинации штаммов E. coli (wp2 [pKM101] и uvrA) без активации и с активацией фракцией S9.

Как следует из полученных данных, при однократном и при курсовом внутрижелудочном введении белым крысам в терапевтической дозе тестируемого образца (ГЛФ РУ-31) – 10 мг/кг и 1/10 от LD 50 (93 мг/кг) увеличения уровня клеток костного мозга, содержащих аберрации хромосом, не наблюдалось. В группе положительного контроля (циклофосфамид, 20 мг/кг, однократно и пятикратно, внутрибрюшинно) наблюдалось значительное возрастание доли клеток с аберрациями хромосом. Доля клеток с хромосомными аберрациями составила для самцов (27,8 ± 3,3) % при однократном введении и (28,4 ± 2,)1 % при пятикратном введении, для самок – (26,8 ± 2,2) % при пятикратном введении. Таким образом, результаты, полученные при изучении мутагенной активности ФС РУ-31 в диапазоне концентраций 0,019531 мг/мл; 0,039063 мг/мл; 0,078125 мг/мл; 0,15625 мг/мл; 0,3125 мг/мл и 0,625 мг/мл в ходе проведения теста in vitro на индукцию генных мутаций (тест Эймса) на штаммах S. typhimurium ТА98, ТА100, ТА1535, ТА1537 и комбинации штаммов E. coli (wp2 [pKM101] и uvrA), свидетельствуют об отсутствии мутагенной активности. В условиях цитогенетического теста in vivo при внутрижелудочном введении белым беспородным крысам ГЛФ РУ-31 в изучаемых дозировках также не выявлено мутагенной активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В соответствии с проводимой в РФ политикой и международными требованиями в сфере обращения лекарственных средств, направленными на обеспечение населения эффективными и безопасными в первую очередь отечественными лекарственными средствами, созданными на основе достижений биологии, медицины и фармацевтических технологий, проведены доклинические иссле-дования противомигренозного лекарственного средства, улучшающего мозговой кровоток с 5-НТ2-антагонистическим действием, производного 2-метоксифенил-имидазо-бензими-дазола в виде фармацевтической субстанции и готовой лекарственной формы (ФС и ГЛФ РУ-31) в тестах in vitro и in vivo по определению их мутагенного потенциала. Результаты исследований по безопасности к возможному риску применения для данного разрабатываемого лекарственного средства показали отсутствие мутагенной активности, что позволяет рекомендовать проведение дальнейшей разработки.