Оптические свойства нейтрофилов периферической крови лошадей при общем внешнем воздействии -излучения

Известно, что важным диагностическим тестом при выявлении заболеваний сельскохозяйственных животных считается определение содержания форменных элементов крови, в том числе нейтрофилов (1-4). Нейтрофилы (нейтрофильные гранулоциты) представляют собой фактор неспецифической резистентности, обеспечивающий первый этап иммунного ответа на бактериальные и другие патогены и предшествующий более специфическому лимфоцитарному (5, 6). Эти клетки способны к фагоцитозу (7-9), но они также признаются универсальными эффекторами гомеостаза (10, 11). Нейтрофил рассматривается как своеобразная одноклеточная секреторная железа, реализующая эффекторный потенциал, в том числе секретируя растворимые продукты — про- и противовоспалительные цитокины, анафилотоксины и другие бактерицидные и цитотоксические вещества в зависимости от выполняемых функций (12-14). У нейтрофильных гранулоцитов имеются рецепторы для огромного числа эндогенных медиаторов (сигнальных молекул), которые запускают определенные сигнальные системы, влияющие на конкретные биохимические процессы в клетке (15795

17). Они способны отвечать на воздействие цитокинов повышением экспрессии генов, участвующих в реализации иммунного ответа, и появлением рецепторов, присущих антигенпрезентирующим клеткам (18, 19). Кроме того, секретируя биологически активные вещества, нейтрофильные гранулоциты могут оказывать регулирующее влияние на функции других иммунокомпетентных клеток (20-22). Все это дает нейтрофилам возможность быстро реагировать на малейшие изменения постоянства внутренней среды организма, что позволяет рассматривать эти клетки в качестве своеобразного «зеркала гомеостаза».

Нейтрофилы и их качественные и количественные характеристики имеют важное значение для оценки состояния здоровья при лучевом поражении животных и радиационно-индуцированной гибели предшественников гранулоцитарных клеток в костном мозге (23). Особый интерес представляет исследование этих полиморфноядерных лейкоцитов у лошадей — животных со специфической физиологией и метаболизмом, а также особым соотношением форменных элементов крови с большим количество нейтрофилов (45-62 % против соответственно 20-35 % и 35-45 % у крупного рогатого скота и овец) (2). При этом исследования состояния нейтрофилов при радиационных воздействиях на организм сельскохозяйственных животных (24, 25) и другие виды млекопитающих (26-31) весьма немногочисленны.

Представленные в настоящей работе данные по оценке нейтрофильного пула периферической крови лошадей и изменению оптической плотности суспензии нейтрофилов при лучевом поражении животных в полулетальной и сублетальных дозах на разных стадиях развития патологии существенно пополняют знания в этой области, так как подобные сведения в литературе практически отсутствуют.

Целью работы стало исследование оптических свойств нейтрофилов, выделенных из периферической крови лошадей после общего внешнего воздействия γ-излучения в широком диапазоне доз.

Методика. Эксперименты выполняли на 24 лошадях (беспородных кобылах) 3-5-летнего возраста с живой массой 394±0,32 кг, которых содержали в условиях вивария Всероссийского НИИ радиологии и агроэкологии (ВНИИРАЭ). Рацион был сбалансирован согласно нормам ВИЖ (Всероссийский НИИ животноводства, Московская обл.). Контролем служила группа из 4 лошадей, которых содержали в тех же условиях, что и подопытных. Животных четырех опытных групп (I, II, III и IV, по 5 гол. в каждой) подвергали общему внешнему воздействию γ-излучения в дозах соответственно 2, 3, 4 и 5 Гр при мощности дозы 1 Гр/ч на установке ГУЖ-24 (Россия) (источник излучения — ¹³⁷Cs с энергией γ-квантов 0,67 МэВ). Степень и равномерность облучения контролировали с помощью дозиметра VAJ-18 (Германия) со сферической ионизационной камерой VAК-253 (Германия). Неравномерность γ-поля не превышала 15 %.

Общее состояние, поведение, реакцию на внешние раздражители, аппетит, температуру тела, частоту пульса и дыхания, функциональное состояние желудочно-кишечного тракта, динамику живой массы, продолжительность жизни и гематологические показатели животных учитывали общепринятыми способами.

Oбразцы периферической крови отбирали из яремной вены до и на 1-е, 3-и, 5-е, 7-е, 10-е, 15-е, 20-е, 25-е и 30-е сут после общего внешнего воздействия γ-излучения. Антикоагулянтом служил цитрат натрия в конечной концентрации 0,38 %. Нейтрофилы выделяли разработанным нами способом центрифугирования образцов крови в градиенте изоплотностно-го вещества с d = 1,077 г/см3 (32). Выделенные клетки отмывали посред-796

ством однократного центрифугирования при 200 g и 20 °С в течение 10 мин в среде, содержащей NaCl, KCl, K2HPO4, MgCl2, глюкозу и 5-N-2-(гидрок-сиэтил)пиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (соответственно 145; 5; 0,5; 1; 3 и 10 ммоль/л, рН 7,4) («Merck», Германия).

Содержание нейтрофилов в периферической крови оценивали при подсчете общего числа лейкоцитов под микроскопом Биолар-2 (Польша) в образцах цельной крови с последующим определением процента нейтрофилов в мазках (1). Жизнеспособность выделенных клеточных популяций нейтрофилов контролировали в тесте с трипановым синим («Sigma-Aldrich», США). Фотометрический анализ суспензий нейтрофилов выполняли на спектрофотометре СФ-26 (Россия) при X = 600 нм и длине оптического пути 1 см (31).

Представлены средние ( Х ) и стандартные ошибки средних (± х ). Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием t -критерия Стьюдента. Различия между контрольными и опытными значениями считали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты. Жизнеспособность выделенных клеточных популяций нейтрофилов, оцениваемая в тесте с трипановым синим, составила 92-97 %. Нейтрофилы — крупные клетки (9-15 мкм), поверхность которых имеет небольшие шероховатости, мелкие складки, пузыревидные и палочковидные выпячивания (5). Есть данные, что некоторые физико-химические факторы могут модифицировать адгезивность нейтрофилов (24, 33, 34). Поэтому следовало выяснить, влияет ли радиационное воздействие в широком диапазоне доз на оптические свойства нейтрофилов, поскольку изменение формы и поверхности клеток, а также образование клеточных конгломератов могут изменять светопоглощение. Для этого определяли величину оптической плотности суспензии нейтрофилов в расчете на 10⁵ кл/мл у облученных в дозах 2, 3, и 4 Гр и контрольных лошадей. Как оказалось, этот показатель в контроле и опыте достоверно не различался (табл. 1). Среднее значение у необлученных лошадей равнялось 0,567±0,021 отн. ед. при средней величине для всех измерений 0,572±0,023 отн. ед., то есть приведенная величина оптической плотности суспензии нейтрофилов в расчете на 10⁵ кл/мл, что практически соответствует оптической плотности одной клетки, в разные сроки после облучения лошадей в дозах 2, 3 и 4 Гр была фактически постоянной и в большинстве случаев составляла 0,570-0,600 отн. ед. (см. табл. 1).

1. Оптическая плотность (отн. ед. в расчете на 10⁵ кл/мл) суспензии нейтрофилов, выделенных из цельной периферической крови лошадей, в зависимости от дозы внешнего γ -излучения в разные сроки после воздействия ( Х ± х, виварий Всероссийского НИИ радиологии и агроэкологии, г. Обнинск)

Период, сут	Доза внешнего γ -излучения, Гр			Необлученные лошади ( n = 4)
	2 ( n = 5)	3 ( n = 5)	4 ( n = 5)
До воздействия (исходные данные)	0,565±0,027	0,573±0,019	0,582±0,023	0,567±0,021
После воздействия: 1-е	0,593±0,023	0,571±0,018	0,579±0,021	0,573±0,023
3-и	0,598±0,019	0,592±0,021	0,568±0,017	0,572±0,018
7-е	0,614±0,035	0,597±0,026	0,592±0,024	0,578±0,022
10-е	0,595±0,022	0,603±0,025	0,571±0,032	0,587±0,027
15-е	0,603±0,027	0,564±0,017	0,567±0,026	0,575±0,019
20-е	0,562±0,018	0,581±0,026	0,585±0,025	0,588±0,024

Следовательно, оптические свойства нейтрофилов лошадей, регистрируемые по величине светопоглощения при X = 600 нм, не претерпевают существенных изменений при развитии у животных острой лучевой патологии легкой и средней степени тяжести, что делает правомочным проведение фотометрического анализа этих клеток.

Изучение оптической плотности суспензии нейтрофилов, выделенных из периферической крови лошадей, которых подвергли воздействию γ -излучения в широком диапазоне доз, выявило следующие особенности. Величина оптической плотности аликвоты суспензии у всех необлученных лошадей составила 0,235+0,032 отн. ед. (табл. 2).

2. Оптическая плотность (отн. ед.) аликвоты суспензии нейтрофилов, выделенных из цельной периферической крови лошадей, в зависимости от дозы внешнего γ -излучения в разные сроки после воздействия ( Х ± х , виварий Всероссийского НИИ радиологии и агроэкологии, г. Обнинск)

Период, сут	Контроль	Доза γ -излучения, Гр
		2 ( n = 5)     1	3 ( n = 5)	4 ( n = 5)	5 ( n = 5)
До воздействия
(исходные данные)	0,232±0,017	0,228±0,047	0,230±0,019	0,251±0,039	0,234±0,022
После воздействия:
1-е	0,227±0,028	0,615±0,047*	0,650±0,099*	0,534±0,480*	0,585±0,058*
3-и	0,234±0,025	0,253±0,055	0,334±0,055*	0,296±0,052	0,323±0,037*
5-е	0,222±0,018	0,169±0,034	-	0,132±0,024*	0,150±0,056*
7-е	0,247±0,019	0,174±0,030	0,202±0,063	0,171±0,018*	0,318±0,057*
10-е	0,235±0,022	0,221±0,035	0,339±0,060	0,200±0,041	0,013±0,004*
15-е	0,228±0,017	0,146±0,025*	0,173±0,048	0,166±0,048*	-
20-е	0,218±0,014	0,061±0,012*	0,079±0,023*	0,056±0,014*	-
25-е	0,229±0,013	0,050±0,006*	0,026±0,007*	0,024±0,004*	-
30-е	0,228±0,016	0,030±0,004*	0,019±0,004*	0,022±0,003*	-

П р и м еч а ни е. Прочерк означает отсутствие данных.

* Различия с исходными данными статистически значимы при р < 0,05.

Воздействие γ-излучения, вызывающее острое лучевое поражение лошадей от легкой до средней степени тяжести, приводило в начальный период (1-е-3-и сут) к значительному (на 1-е сут — в 2,1-2,8 раза, на 3-и — в 1,1-1,5 раза) повышению оптической плотности суспензии нейтрофилов по сравнению с показателями у необлученных животных, а на 5-7-е сут при облучении в дозах 2, 3 и 4 Гр она была несколько ниже исходной. Доза 5 Гр вызывала уменьшение показателя (в 1,6 раза) на 5-е сут и увеличение (в 1,4 раза) — на 7-е сут. При дозах 2, 3 и 4 Гр на 10-е сут оптическая плотность вновь возрастала до контрольных значений и даже выше (при 3 Гр), а в последующие сроки неуклонно и многократно снижалась: на 20-е сут — в 3,7; 2,9 и 4,5 раза, на 25-е сут — в 4,6; 8,9 и 10,5 раза, на 30-е сут — в 7,6; 12,1 и 11,4 раза. У лошадей, облученных в дозе 5 Гр, на 10-е сут отмечали резкое снижение показателя (в 18 раз), после чего все животные погибли. При этом мы не выявили зависимости между величиной оптической плотности суспензии нейтрофилов и дозой γ-излучения.

Таким образом, общее внешнее воздействие γ-излучения в сублетальных и полулетальной дозах приводило к лучевому поражению лошадей легкой и средней степени тяжести, которое сопровождалось повышением величины оптической плотности суспензии нейтрофилов в начальный период, последовательным снижением и увеличением показателя в латентный период и резким уменьшением в период разгара (20-30-е сут) .

При фотометрическом исследовании нейтрофилов возникло предположение, что величина оптической плотности суспензии клеток отражает их количественное содержание в периферической крови животных. Для уточнения мы сопоставили данные по величине оптической плотности аликвоты суспензии нейтрофилов и содержанию нейтрофилов в периферической крови облученных и необлученных лошадей, оцененному традиционным гематологическим способом.

У необлученных лошадей величина оптической плотности аликвоты суспензии составляла 0,230±0,190 отн. ед. (табл. 3). После общего внеш-798

него воздействия у-излучения в дозе 3 Гр развивалось лучевое поражение, которое сопровождалось повышением величины оптической плотности аликвоты суспензии нейтрофилов в 2,8 раза на 1-е сут после облучения, снижением на 3-и-10-е сут практически до контрольных значений и уменьшением в 2,9 раза на 20-е сут в сравнении с исходными данными. Соответствующий показатель в контрольной группе животных во все сроки исследования оставался в пределах исходных значений. При этом содержание нейтрофилов в периферической крови облученных лошадей изменялось аналогичным образом (см. табл. 3). У необлученных лошадей оно составляло в среднем (12,9±0,8)х109/л и в течение 20 сут практически не изменялось. У лошадей, подвергнутых общему внешнему воздействию у-излучения в дозе 3 Гр, содержание нейтрофилов в периферической крови увеличивалось на 1-е сут в 3,2 раза в сравнении с исходными данными, снижаясь практически до значений, отмеченных у необлученных животных, на 3-и-10-е сут (см. табл. 3). На 20-е и 25-е сут число этих клеток в крови лошадей уменьшалось в 2,8 и 8,6 раза в сравнении с исходными данными. Следовательно, результаты гематологической оценки содержания нейтрофилов в периферической крови у облученных лошадей свидетельствовали о нейтрофилезе на 1-е сут, вызываемом абортивным выбросом клеток из пула костного мозга, и нейтропении на 20-25-е сут при радиационно-индуцированном истощении пула предшественников гранулоцитов в костном мозге.

3. Содержание нейтрофилов в крови и величина оптической плотности аликвоты суспензии нейтрофилов, выделенных из крови облученных (3 Гр) и необ-лученных лошадей ( Х ± х , виварий Всероссийского НИИ радиологии и агроэкологии, г. Обнинск)

Период, сут	Оптическая плотность, отн. ед.		Содержание нейтрофилов, ½109/л
	контроль ( n = 4)	опыт ( n = 5)	контроль ( n = 4)	опыт ( n = 5)
До воздействия
(исходные данные)	0,230±0,19		12,9±0,8
После воздействия:
1-е	0,226±0,11	0,650±0,099*	12,7±1,3	41,1±7,2*
3-и	0,243±0,08	0,334±0,155	13,4±2,2	12,1±5,3
7-е	0,235±0,09	0,202±0,063	11,8±2,6	10,3±3,2
10-е	0,244±0,13	0,339±0,060	12,9±1,8	13,7±6,4
20-е	0,238±0,23	0,079±0,023*	13,3±1,9	4,6±0,9*
25-е	0,231±0,29	0,026±0,007*	12,8±2,1	1,5±0,7*
* Различия с исходными данными статистически значимы при р < 0,05.

Таким образом, число нейтрофилов в периферической крови лошадей, определяемое под микроскопом прямым подсчетом, и оптическая плотность суспензии выделенных нейтрофилов изменялись после облучения животных сходным образом. Значения обоих показателей увеличивались на 1-е сут соответственно в 3,2 и 2,8 раза, на 7-10-е сут не отличались от исходных данных, на 20-е сут снижались в 2,8 и 2,9 раза, на 25-е — в 8,6 и 8,9 раза.

Отметим, что между регистрируемыми показателями наблюдалась хорошая корреляция во все сроки после облучения животных. Исходя из такой однотипной динамики, можно сделать вывод о допустимости применения фотометрического анализа суспензий выделенных нейтрофилов при исследовании изменения их содержания в крови лошадей.

Нейтрофилы (точнее — предшественники гранулоцитов) млекопитающих в норме созревают в костном мозге в течение 8-12 сут, затем выходят в периферическую кровь, где пребывают 8-10 ч, далее поступают в различные ткани и через 3-5 сут подвергаются спонтанному апоптозу (запрограммированной клеточной гибели) (35-38), а при некоторых состояниях — нетозу (39-43). Внешнее воздействие у-излучения в сублетальных и полулетальной дозах вызывает гибель предшественников гранулоцитов в костном мозге, что определяет снижение содержания нейтрофилов в периферической крови после 12-х сут (23). Наши исследования показали в этот период (на 20-30-е сут) резкое уменьшение оптической плотности суспензии нейтрофилов у лошадей I, II и III групп и на 10-е сут — у животных IV группы. Иными словами, лучевое поражение лошадей, подвергнутых внешнему воздействию γ-излучения в дозах от сублетальной до по-лулетальной, в период разгара характеризуется значительным (2,9-18,0-кратным) снижением оптической плотности суспензии нейтрофилов. Максимальное уменьшение показателя отмечали на 10-е сут у лошадей, облученных в полулетальной дозе (5 Гр). Следует отметить, что оптическая плотность суспензии нейтрофилов у лошадей, облученных в сублетальных дозах (от 2 до 4 Гр), фактически не различалась с 7-х по 30-е сут. При воздействии в полулетальной дозе динамика была совершенно иной: увеличение на 1-е-3-и сут, снижение ниже контроля на 5-е, повышение в 1,4 раза на 7-е сут и резкое уменьшение (в 18 раз) на 10-е сут. То есть в период разгара лучевой патологии легкой и средней степени тяжести при значительном снижении величины оптической плотности суспензии выделенных нейтрофилов, что практически соответствует уменьшению их содержания в периферической крови лошадей, можно с уверенностью прогнозировать как возникновение, так и усиление имеющихся инфекционных процессов в организме. Кроме того, есть основания ожидать, что сниженный в этот период в 10-12 раз пул нейтрофильных гранулоцитов в крови облученных животных вызовет изменение основных звеньев иммунного ответа нейтрофилов, а также нарушение их регулирующего влияния на функции других иммунокомпетентных клеток в связи со значительно уменьшенной секрецией цитокинов и других биологически активных веществ даже при воздействии γ-излучения в сублетальных дозах.

Итак, проведенные исследования показали, что общее внешнее воздействие γ-излучения в изученном диапазоне доз приводит к изменению оптической плотности суспензии выделенных нейтрофилов, которое согласуется с динамикой содержания этих клеток в периферической крови лошадей. Величина оптической плотности суспензии выделенных нейтрофилов может применяться в ветеринарной практике для экспресс-оценки пула нейтрофильных гранулоцитов в периферической крови животных.