Оптимизация этапа аутолиза гомогената селезенки яков на основе математического метода планирования эксперимента

Уникальные свойства эндогенных медиаторов давно уже привлекали к себе пристальное внимание в плане разработки средств коррекции тех или иных изменений в работе системы иммунитета. Наибольшие успехи в этом направлении стали возможными после открытия регуляторных пептидов центральных органов иммунитета (тимуса и костного мозга), а впоследствии и периферических органов иммунной системы. В настоящее время в клинической практике применяются следующие препараты тимуса, костного мозга, селезенки и их синтетические аналоги: тималин, тактивин, тимозин, тимактид, спленин, миелопид и пр. На основе пептидных биорегуляторов разработан новый класс природных биологически активных добавок к пище, получивших название «цитамины». Цитамины, не являясь лекарствами, оказывают физиологическое воздействие на те органы и ткани, из которых эти биорегуляторы были выделены. Вследствие этого выделение регуляторных пептидов из органов иммунной системы номадных животных в настоящее время представляется перспективным с точки зрения разработки безотходных технологий за счет глубокой переработки экологически чистого эндокринно-ферментного сырья. В разные годы использовались различные технологии выделения: экстрагирование изотоническим раствором хлорида натрия, автолиз и последующая экстракция, экструзионная деструкция, кислотный гидролиз, ультрафильтрация, препаративный электрофорез и др [1].

В 1981 г. В.Я. Арионом и соавторами из аутолизата тимуса был получен тактивин – комплексный препарат, содержащий пептиды с молекулярной массой от 1,5 до 6 кДа. За время, прошедшее с момента создания препарата, его использовали для лечения широкого круга заболеваний, сопровождавшихся формированием вторичного иммунодефицитного состояния [2].

Известно, что основными факторами, влияющими на процесс автолиза, являются температура, продолжительность, гидромодуль (соотношение массы изотонического раствора хлорида натрия к массе сырья).

Таблица 1

Уровни изучаемых факторов

Фактор	Уровень
	1	2	3	4	5
X 1 , Температура, 0С	0	4	15	25	38
X2, Продолжительность, час	24	16	14	10	8
X3, Гидромодуль	1:4	1:3	1:2,5	1:2	1:1,5

Для оценки степени влияния технологических параметров на выход эффекторных пептидов, выделенных из селезенки аборигенных яков, и оптимизации этапа автолиза применяли факторные эксперименты с использованием математического метода Протодьяконова.

Уровни изучаемых факторов приведены в таблице 1.

На основе запланированных уровней факторов была составлена матрица трехфакторного эксперимента на пяти уровнях (табл. 2), по которой было проведено 25 опытов. Структура матрицы такова, что при проведении всех экспериментов каждый уровень любого фактора встречается один раз с каждым уровнем всех остальных факторов. Для этого каждый уровень каждого фактора задавали в эксперименте столько раз, сколько принято уровней. Этим обеспечивается усреднение действия любого фактора, т.е. обеспечивается тот же самый эффект, который достигается при бесконечно большом числе экспериментов со случайной вариацией всех факторов [3]. В колонку Y э заносятся экспериментальные данные, полученные при определении количественного содержания эффекторных пептидов в аутолизатах селезенки. Концентрацию эффекторных пептидов измеряли колориметрическим методом Лоури [4].

Исходя из матрицы планирования экспериментов (табл. 2), была произведена выборка на точечные графические зависимости.

Таблица 2

Матрица трехфакторного эксперимента на пяти уровнях

№ опыта (аутолизата)	X 1	X 2	X 3	Y э	Y п	Y э -Y п
1	0	24	1:4	3,44	1,78	1,66
2	0	14	1:2,5	4,68	1,92	2,76
3	0	16	1:3	5,36	1,85	3,51
4	0	8	1:1,5	4,88	2,16	2,72
5	0	10	1:2	3,15	2,01	1,14
6	15	24	1:2,5	4,9	4,68	0,22
7	15	14	1:3	6,72	4,53	2,19
8	15	16	1:1,5	6,56	5,29	1,27
9	15	8	1:2	5,92	4,9	1,02
10	15	10	1:4	3,2	4,36	-1,16
11	4	24	1:3	1,75	2,59	-0,84
12	4	14	1:1,5	2,12	3,02	-0,9
13	4	16	1:2	5,5	2,8	2,7
14	4	8	1:4	3,2	2,49	0,71
15	4	10	1:2,5	2,88	2,67	0,21
16	38	24	1:1,5	10,8	9,64	1,16
17	38	14	1:2	7,8	8,93	-1,13
18	38	16	1:4	8,82	7,94	0,88
19	38	8	1:2,5	8,6	8,53	0,07
20	38	10	1:3	8,6	8,25	0,35
21	25	24	1:2	5,3	6,71	-1,41
22	25	14	1:4	4,02	5,97	-1,95
23	25	16	1:2,5	5,8	6,41	-0,61
24	25	8	1:3	6,56	6,2	0,36
25	25	10	1:1,5	6,16	7,24	-1,08

Таблица 3

Экспериментальные значения частных функций

Функция	Уровень					Среднее значение
	1	2	3	4	5
Y 1	4,3	3,09	5,46	5,57	8,92	5,47
Y 2	5,24	6,41	5,07	4,8	5,83	5,47
Y 3	4,54	5,8	5,37	5,53	6,1	5,47

Общее среднее Y ср =5,47.

Легко убедиться, что при выборке на все пять уровней каждого фактора используются все 25 значений эксперимента. Это значит, что среднее значение пяти уровней каждой функции равно общему среднему, в данном случае 5,47. Совпадение среднего значения каждой функции с общим средним является критерием отсутствия ошибки, поэтому вычисление этих средних является обязательным. Данные таблицы 3 нанесены на график (рис. 1).

На основе экспериментальных значений частных функций были построены графические зависимости. Масштаб выбирался таким образом, чтобы интервал изменения фактора укладывался примерно на такую же длину, что и интервал изменения функции. Далее была заполнена таблица значений частных функций, в которой Y 1 , Y 2 и т.д. – частные функции соответственно факторов X 1 , X 2 и т.д. Выборку на уровни делали из экспериментальных данных, приведенных в таблице.

О 5      10     15     20     25     30     35     40

Температура, °С

8                    16                   24                   32

Продолжительность, ч

0,25                                0,5                                0,75

Гидромодуль

Рис. 1. Точечные графики и кривые аппроксимации

Расчетные значения частных функций

Таблица 4

Функция	Уровень					ср
	1	2	3	4	5
Y 1 = -0.00045*X 1 *X 1 +0.193*X 1 +1.941	1.94	2.71	4.74	6.49	8.64	4.9
Y 2 = -0.00795*X 2 *X 2 +0.263*X 2 +3.57	5.29	5.74	5.69	5.4	5.16	5.46
Y 3 =0.25713*X 3 *X 3 +2.319*X 3 +4.43	5.03	5.22	5.4	5.65	6.10	5.48

После подбора всех частных зависимостей расчетные их значения при матричных уровнях аргументов свели в таблицу 4. О близком соответствии алгебраических зависимостей точечным графикам свидетельствовало незначительное отличие средних расчетных значений всех функций от общего среднего, равного 5,47. Среднее значение Y э совпадало с общим, так как эта функция найдена методом наименьших квадратов. Общее среднее, полученное из теоретических значений частных функций, равно 5,28 и отличается от экспериментального общего среднего на 0,19, что свидетельствует о компенсации отклонений частных функций при их обобщении (табл.4).

Общее среднее всех расчетных значений Y р ср =5,28.

Обобщенное уравнение Протодьяконова имеет вид:

Yп=((-0,00045*X 1 *X 1 +0,1932475219*X 1 +1,941)*(-0.00795*X 2 *X 2 +0,2626869247*X 2 +3,57)*(0,25713*X 3 *X 3 +2,3187899604*X 3 +4,43))/(5,47*5,47)

Самый простой случай оптимизации - выбор максимальных значений всех частных функций по графикам и подстановка соответствующих условий в обобщенную формулу. Так, для рассматриваемого примера нужно выбрать температуру 38 0С, продолжительность 16 часов, гидромодуль 1:1,5. В этом случае ожидаемое содержание белка 9,64 мг/мл.

Поскольку исследования касались биологической субстанции, необходимо было не только увеличить количественное содержание эффекторных пептидов, но и сохранить ее иммунобиологические свойства.

Для оценки биологической активности было выбрано шесть опытных образцов (№№ 3,7,13,16,18,24) с максимальным содержанием эффекторных пептидов с учетом влияния температурного фактора, а также образец, полученный в условиях оптимизации этапа аутолиза. Изучение биологической активности аутолизатов селезенки в реакции «активного розеткообразования» тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика проводили согласно ВС 42-1571-85. Обработанные трипсином тимоциты использовались в качестве контроля, нормой являлись нативные тимоциты. В эксперименте исследовалась способность тестируемых аутолизатов восстанавливать рецепторы «лысых» тимоцитов, обработанных трипсином. Образование рецепторов оценивали по присоединению к тимоциту эритроцитов (рис. 2).

Рис. 2. Реакция «активного розеткообразования» тимоцитов морской свинки с эритроцитами кролика in vitro

Как видно из представленной диаграммы, обработка нативных тимоцитов трипсином приводила к снижению в 3,1 раза количества тимоцитов морской свинки, имеющих на поверхности Е-рецепторы. Введение тестируемых образцов №№ 7,13, 24 усиливало экспрессию мембранных рецепторов в 2,4; 2,2; 2 раза соответственно по сравнению с уровнем Еа-РОК тимоцитов, обработанных трипсином. В свою очередь, аутолизаты №№ 3, 16, 18 проявляли менее выраженное действие на розеткообразующую функцию тимоцитов, восстанавливая Еа-РОК в 1,6-1,75 раза от уровня супрессии. Из таблицы 2 видно, что эти аутолизаты были выделены при температуре 0 и 38 0С. Анализ образца, выделенного в условиях оптимизации этапа аутолиза, показал, что экспрессия мембранных рецепторов усиливалась незначительно (в 1,6 раза) по сравнению с уровнем Еа-РОК тимоцитов, обработанных трипсином. Таким образом, можно заключить, что максимальное содержание эффекторных пептидов не коррелирует с биологической активностью.

На следующем этапе работы проводилось изучение иммуномодулирующей активности. В ходе исследования нами были использованы аутолизаты селезенки яков с высокой (№ 7), средней (№ 13) и низкой (№ 24) биологической активностью.

Иммунобиологическая активность выделенных аутолизатов изучалась на лабораторных животных – белых мышах - самцах весом 18-20 г. Животные были поделены методом случайной выборки на несколько групп. Первая группа мышей – интактная – животные находились на общевиварном рационе. У второй группы животных иммунодефицит воспроизводили пероральным введением иммунодепрессанта – цитостатика азатиоприна в концентрации 50 мг/кг массы тела 1 раз в сутки в течение 5 дней. Третьей, четвертой и пятой группам животных до еды на фоне иммуносупрессии вводили тестируемые образцы в дозе 0,1 мг/кг массы тела животного 1 раз в сутки в течение 7 дней.

Оценка влияния аутолизатов на состояние иммунной системы экспериментальных животных осуществлялась путем определения следующих показателей: массы животных, абсолютных и относительных значений масс органов иммунной системы (тимуса и селезенки), клеточности тимуса и селезенки, индекса реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и титра гемагглютининов (ГА).

Показатель титра гемагглютининов, отражающий функциональную активность В-системы иммунитета, и индекс реакции ГЗТ, характеризующий активность Т-системы иммунитета, определяли согласно МУК 2.3.2.721-98 [5].

Статистическую обработку данных проводили вычислением средних арифметических и их доверительных интервалов при р < 0,05. Для оценки достоверности результатов использовали параметрический критерий статистической обработки данных по методу Стьюдента.

В результате проведенных исследований установлено, что под воздействием иммунодепрессанта азатиоприна в экспериментальной группе №2 наблюдалось снижение показателей массы тела животных, абсолютных и относительных значений масс тимуса и селезенки, а также их клеточности. Использование же аутолизатов приводило к восстановлению данных показателей.

Показатели клеточности иммунных органов, а также результаты реакций ГЗТ и ГА приведены в таблице 5.

Таблица 5

Влияние аутолизатов селезенки на клеточность тимуса и селезенки, индекс реакции ГЗТ и титр гемагглютининов (ГА) на фоне азатиоприновой иммуносупрессии (М±m, n=10)

№ гр	Вариант опыта	Клеточность селезенки, *106	Клеточность тимуса,*106	Индекс реакции ГЗТ	Титр ГА, 1/Т
1	Интактная	126±9,0	57,8±4,1	0,35±0,03	31,6±4,9
2	Азатиоприн (Аз)	102±10,5	50,3±3,9	0,22±0,03*1	2,9±0,6*1
3	Аз+Опыт 7	136,5±4,9*2	55,8±3,0	0,32±0,03*2	20,0±3,9*2
4	Аз+Опыт 13	127,5±19,0	69,3±6,9*2	0,31±0,03	8,0±1,9*2
5	Аз+Опыт 24	167±11,3*1,2	51,5±2,5	0,31±0,04	6,4±0,8*2

Примечание.*¹ , ² - различия достоверны относительно первой или второй группы

К числу эффектов, направленность которых определяется видом клеток-мишеней и характером имеющихся повреждений, в первую очередь следует отнести формирование иммунного ответа на ти-мусзависимый антиген, в качестве которого использовали эритроциты барана, отмытые изотоническим раствором хлористого натрия. Как следует из представленных данных, применение аутолизатов селезенки на фоне иммуносупрессии способствовало увеличению количества антиэритроцитарных антител. Введение этих образцов в третьей, четвертой и пятой группах восстанавливало показатель реакции ГА на 63,3; 25,3; 20,3 % соответственно по отношению к интактной группе животных. Опытные образцы оказали также положительное влияние на реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Все аутолизаты, влияющие на клеточное звено иммунитета, вызвали изменение индекса реакции относительно второй группы.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют об иммунобиологической эффективности полученных образцов, так как они позволяют восстанавливать показатели клеточного и гуморального звеньев иммунитета на фоне иммунодепрессии, вызванной азатиоприном.

• 1.    В результате математического планирования эксперимента установлены оптимальные параметры этапа аутолиза, которые могут быть рекомендованы для максимального извлечения биологически активных пептидов.

• 2.    Количественное содержание эффекторных пептидов не коррелирует с иммунобиологической активностью аутолизатов.

• 3.    Аутолизат селезенки, выделенный при следующих режимах (температура – 15 ⁰С, продолжительность – 14 часов, гидромодуль 1:3), характеризуется наиболее выраженной иммуномодулирующей эффективностью.

• 2.    Arion V.Y. Taktivin (T-activin) and its immunological activity // Immunоbiology of thymus hormones: Ed. by Y.A. Grinevitch, V.F. Chebotareva. Kiev: Zdorovje, 1989. P. 103-125.

• 3.    Malyshev V.P. Mathematical planning of metallurgical and chemical experiments. - Alma-Ata. “Nauka” Press, 1977. – 37 p.

• 4.    Lowry O., Rosebroungh N.J., Farr A.L. et. al. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol.Chem. -1951. - V. 193. - № 1. - Р. 265-275.

• 5.    Methodological instructions 2.3.2.721-98. Definition of safety and effectiveness of the biologically active nutritive complements.