Оптимизация микрокапсулирования биологически активных веществ (пепсина) для использования в пищевой промышленности

Современная наука в области пищевой биотехнологии имеет значительный комплекс новых и усовершенствованных технологий, направленных на улучшения качества и полезности пищевой продукции. Известны различные технологии микрокапсулирования полезных пищевых ингредиентов (пробиотики, витамины, ферменты), исследованные в работах [1 - 8]. Исследователи пришли к выводу, что термостабильный и легкоусвояемый материал стенок является определяющим для стабильных витаминных микрокапсул. Природные пищевые углеводы или белки - подходящие кандидаты для материалов защитного слоя микрокапсул. Исследователи Ballesterosetal, Jeyakumarietal, Santanaetal, Вилесова и др. предлагают использовать различные материалы для стенок защитного слоя в капсулировании пищевых ингредиентов: хитозан, желатин, мальтодекстрин, сывороточный белок, казеинат натрия, модифицированные крахмалы, гуммиарабик [9 - 12].

Мальтодекстрин обычно используется для образования защитного слоя, получают микрокапсулы с высокой растворимостью в воде, низкой вязкостью, незначительным содержанием сахара. Эти свойства делают мальтодекстрин наиболее распространенным защитным материалом стенок при микрокапсулировании. Желатин также является хорошим выбором в качестве материала стенок, особенно при распылительной сушке, благодаря его хорошим свойствам эмульгирования, пленкообразования, растворимости в воде, высокой стабилизирующей активности и тенденции к образованию тонкой плотной сетки. Гуммиарабик, природный бесцветный растительный полисахаридный экссудат акации, хорошо известен как эффективный материал для стенок из-за его стабильного образования эмульсии и хорошего удержания летучих веществ и поэтому активно используется в течение многих лет [5].

На основе имеющегося опыта и анализа результатов научных исследований в области микрокапсулирования можно заключить, что в передовых научных исследованиях на данном этапе пока не выделяются однозначно эффективные технологии микрокапсулирования и универсальные материалы для стенок микрокапсул, но предлагаются варианты, которые отвечают задачам повышения качества пищевых продуктов. Данная идея находит свое подтверждение в работах [13, 14]. Каждый метод микрокапсулирования имеет преимущества и недостатки, в том числе неэффективный материал ядра, сложность процедуры, низкую эффективность инкапсуляции или проблемы с точки зрения воспроизводимости [15]. Ни один процесс инкапсуляции не может быть адаптирован ко всем основным материалам или применению продукта в силу несоответствия их конкретным задачам повышения качества пищевых продуктов. В работах по пищевой биотехнологии были предприняты попытки улучшить свойства микрокапсулирования, где изучалось использование смеси углеводов с белками и полисахаридами в различных пропорциях. Выбор полимерных смесей, которые могут привести к более высокой эффективности инкапсуляции и более низкой стоимости, чем отдельные биополимеры, был предметом повышенного интереса [5, 16 - 19].

Тем не менее в многочисленных работах [2, 5, 20, 21] обоснованным считают применение технологии микрокапсулирования в псевдокипящем слое. Сушка с распылением стала успешной промышленной технологией, основным используемым методом для капсулирова-ния пищевых ингредиентов из-за его невысокой стоимости обработки, быстрого испарения воды и простоты применения и масштабирования.

Выбор подходящего материала для защитных стенок является чрезвычайно важным фактором для капсулирования биологически активных соединений. Этот материал должен защищать вещество ядра от его разрушения, иметь требуемую механическую прочность, быть совместимым с пищевым продуктом, обеспечивать контролируемое высвобождение и/или иметь термические свойства, совместимые со свойствами продукта [17 - 19].

Признавая значимость и опираясь на результаты пищевой инженерии, считаем, что сегодня исследования должны быть направлены на поиск новых перспективных способов микрокапсулирования, включающих технологию микрокапсулирования и материал для защитного слоя. Результативной будет та технология, которая обеспечивает высокое качество микрокапсул, сохраняемость и технологичность капсулированного вещества и экономический эффект.

Цель работы – экспериментально обосновать состав защитного покрытия при микрокапсулировании фермента пепсина и разработать рекомендации по его микрокапсулированию.

Материал и методы исследований

Капсулируемое вещество – пепсин. В эксперименте были изготовлены микрокапсулы с защитным слоем из трех различных материалов: мальтодекстрин, мальтодекстрин с желатином в соотношении 3:1, мальтодекстрин с гуммиарабиком (Е414) в соотношении 3:1; указанная пропорция показала свою эффективность в работах [16 - 18].

При приготовлении мальтодекстрина (MD) в качестве защитного вещества была повторена технология, представленная в работе [21]. Мальтодекстрин и гуммиарабик растворяли (MD + GA) в теплой дистиллированной воде (70 °С) при постоянном перемешивании при 120 об./мин в течение 1 ч и выдерживали в течение ночи при 4 ± 2 °С для регидратации. Желатин растворяли в горячей дистиллированной воде при перемешивании до образования водного раствора, затем вносили мальтодекстрин при постоянном перемешивании до полного растворения всех материалов, получая микрокапсулы (MD + GE). Производство микрокапсул было проведено по единой технологии – в псевдокипящем слое. Микрокапсулы имели различную толщину защитного слоя, которая была обеспечена разной продолжительностью капсу-лирования (большее время нанесения защитного слоя приводит к его большей толщине [20]).

Протеолитическая активность пепсина оценивалась по методу, предлагаемому и апробированному в работах [22 - 24] - путем определения степени гидролиза раствора денатурированного гемоглобина ферментом после инкубации в течение 15 мин при 40 °С. Одна единица (U) активности фермента была принята за количество фермента, которое высвобождает 1 мкмоль тирозина (мин мл)^-1. Реакцию начинали добавлением 0,4 мл раствора фермента (или 10 мг сухих хитозановых гранул, содержащих иммобилизованный фермент, после инкубации в 0,01 М 2 мл HCl при 40 °С для равновесия набухания) к 2,0 мл раствора денатурированного кислотой гемоглобина (10 г). L^-1 приготовили в 0,01 М HCl и смесь осторожно перемешали в пробирке при 40 °С. Через промежутки времени после смешивания реакцию останавливали добавлением 4,0 мл 5,0 % (вес/объем) раствора ТСА. Образцы были подвергнуты центрифугированию и фильтрации. Активность пепсина оценивали по увеличению УФ-поглощения супернатанта при 280 нм.

Контрольными образцами являлся чистый некапсулированный пепсин. Полученные образцы хранили в защищенном от света месте при комнатной температуре. Проверены истинные различия в начале эксперимента и сделаны замеры по прошествии 3, 6, 12, 18 мес. хранения.

Результаты исследования и их обсуждение

Оптимизация микрокапсулирования пепсина означает решение задачи контроля за высвобождением капсулируемого биологически активного вещества и в то же время сохранении его активности при хранении.

В результате проведенного эксперимента были сделаны выводы о влиянии материала для микрокапсулирования на активность пепсина. Поскольку толщина покрытия защитным слоем также оказывает влияние на активность пепсина, то определена степень влияния указанных факторов. Первоначальная активность ферментного препарата рассматривалась в качестве стандарта для оценки его стабильности. Микрокапсулы с различной толщиной защитного слоя демонстрируют лучшее сохранение первоначальной активности фермента (рис. 1).

Рисунок 1 – Активность пепсина для различных микрокапсул

Из рисунка 1 видно, что сохранение наибольшей активности пепсина обеспечено микрокапсулами с двухкомпонентными растворами мальтодекстрина и гуммиарабика, мальтодекстрина и желатина с защитным слоем 6 мкм.

Поскольку наблюдается снижение активности как некапсулированного пепсина, так и в микрокапсулах, следует выявить скорость изменения активности в микрокапсулах по отношению к нативному ферменту. Для этого рассчитали коэффициент опережения, по которому соотносили активность фермента каждого вида образца микрокапсулы с некапсулируемым ферментом, на основе полученных данных построили график (рис. 2).

2,8

2,6

2,4

2,2

1,8

1,6

1,4

1,2

2 мкм

MD, 2 мкм

MD + GA, 2 мкм

MD + GA, 4 мкм

MD + GE, MD + GE, MD + GE,

4 мкм

6 мкм

MD, 4 мкм

MD, 6 мкм

MD + GA, 6 мкм

Рисунок 2 – Коэффициент опережения снижения активности фермента

Из рисунка 2 видно, что наибольшую результативность обеспечили микрокапсулы с защитным материалом из мальтодекстрина и гуммиарабика с защитным слоем толщиной 6 мкм. В целом было выявлено, что большая толщина слоя имеет больший защитный эффект.

18 месяцев хранения

0   3   6   9   12   15   18 месяцев хранения

Рисунок 3 - Динамика протеолитической активности пепсина

Микрокапсулы с пепсином с защитным материалом мальтодекстрина и желатина, мальтодекстрина и гуммиарабика с толщиной слоя 4 и 6 мкм не проявляли потери активности до 18 мес. хранения при 2 °С. У микрокапсул с однокомпонентным защитным слоем мальтодекстрина (при толщине стенок 2 и 4 мкм) протеолитическая активность пепсина снижалась через 8 мес., а не с первого месяца хранения, как для некапсулированного пепсина. Снижение активности объясняется зависящей от времени естественной потерей, и это может быть в значительной степени предотвращено путем микрокапсулирования. Зашитый в матрицу защитного материала из смеси мальтодекстрина с желатином или гуммиарабиком дает преимущество за счет увеличения стабильности фермента в течение всего срока хранения при 2 °С, что определено экспериментом по стабильности при хранении. Данные выводы согласуются с исследованиями [16 - 18].

Выводы

В результате проведенного эксперимента с микрокапсулированием пепсина с различными составами защитного покрытия и толщины были сделаны следующие выводы:

• -    снижение протеолитической активности пепсина в контрольном образце (без капсули-рования) во время хранения было значительным (на уровне значимости р = 0,05);

• -    микрокапсулы с защитным слоем из мальтодекстрина и желатина, мальтодекстрина и гуммиарабика отличались более высокими исследуемыми показателями в сравнении с контрольными образцами и покрытыми только мальтодекстрином (на уровне значимости р = 0,01);

• -    двухкомпонентные защитные материалы растворов мальтодекстрина и гуммиарабика, мальтодекстрина и желатина не показали каких-либо существенных различий в защите (на уровне значимости р = 0,05);

• -    отсутствие отличий в сохранении активности микрокапсулированного пепсина в двухкомпонентные растворы с разной толщиной (4 и 6 мкм) при хранении.

Результаты эксперимента по микрокапсуляции пепсина в псевдокипящем слое позволяют рекомендовать использование раствора мальтодекстрина и гуммиарабика, при этом толщина покрытия должна быть не менее 2 мкм. Увеличение толщины защитного слоя может сопровождаться большими временными расходами и расходами материалов, не обеспечивая роста сохраняемости активности капсулированного фермента на значимом уровне (р = 0,01).

Данная технология и материалы для капсулирования могут быть внедрены в пищевое производство.