Оптимизация подходов к стандартизации сырья пижмы обыкновенной в рамках ресурсосберегающих технологий

Одна из основных задач фармакогнозии в рамках ресурсосберегающих технологий состоит в решении проблем стандартизации лекарственного растительного сырья (ЛРС) и фитопрепаратов, а также разработка объективных методик контроля качества сырья и препаратов. Это в полной мере относится к сырью цветков пижмы обыкновенной ( Tanacetum vulgare L.). В современной медицине цветки пижмы обыкновенной широко применяются в качестве желчегонных и противоглистных лекарственных средств в виде настоя и в составе препаратов «Танацехол» и сбора «Фитогепатол №3» [2-4, 6]. Химический состав цветков пижмы обыкновенной представлен разнообразными группами биологически активных соединений, такими как эфирное масло, флавоноиды, гидроксикорич-ные кислоты [6] и др. На сегодняшний день качество сырья пижмы обыкновенной регламентируется ФС 11 ГФ СССР XI издания [1]. Указанная статья имеет ряд несоответствий современным требованиям, предъявляемым к стандартизации ЛРС. В разделе «Микроскопия» представлены особенности морфолого-анатомического строения не всех частей сырья, а учитывая требованиями ОСТа (91500.05.001.00 Стандарты качества лекарственных средств), указанный раздел должен содержать микрофотографии или рисунки [5]. Раздел «Качественные реакции» отсутствует. В разделе «Количественное определение» приводится многостадийная, трудоемкая методика определения суммы флавоноидов и фенолкарбоновых кислот методом прямой спектрофотометрии буферного раствора упаренного спиртового извлечения цветков пижмы обыкновенной при длине волны 310 нм в пересчете на лютеолин.

Новые инструментальные возможности, а также положения действующего ОСТа требуют

Хусаинова Алия Ильясовна, аспирантка

новый уровень исследований лекарственных растений, что может успешно использоваться для целей экологии. Обоснование и соблюдение этих подходов будет способствовать рациональной заготовке, сушке сырья, его переработке и получению качественных фитопрепаратов, а также разработке надежных методик анализа, которые позволят более экономично использовать сырье и природные ресурсы. Все это создаст предпосылки для более активного механизма использования современных ресурсосберегающих технологий, несмотря на то, что сегодня пижма пока не нуждается в дополнительном культивировании.

Цель исследования: проведение работ по совершенствованию методов стандартизации сырья пижмы обыкновенной в рамках научного обоснования рационального использования растительных ресурсов.

Материалы и методы. Мы исследовали цветки пижмы обыкновенной, собранные в округе г. Тольятти, села Нижнее Санчелеево и села Алексеевка Самарской области (июль 2008 г.), на фармакопейном участке Самарского ботанического сада (июль 2009-2012 гг.). Морфолого-анатомическое исследование осуществляли с помощью микроскопов марки «Motic», стереоскоп DM-39C-N9GO-A и DM-111-Digital Microscopy (Motic Microscopes), при увеличении х20, х40, х100, х400. Колоночную хроматографию осуществляли с использованием силикагеля L 40/100 (Чехия), полиамида марки «Woelm» (Германия).1Н-ЯМР спектры получали на приборах «Bruker AM 300» (300 МГц) и «Gemini-200» (200 МГц), масс-спектры снимали на масс-спектрометре «Kratos MS-30», регистрацию спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках «Силуфол УФ 254» (Чехия), «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ» и «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (Россия) в системах хлороформ-этанол (4:1), хлороформ-этанол-вода (26:16:3). Детекцию веществ проводили в УФ-свете при длине волны 254 нм и 366 нм и обработкой хроматограмм раствором диазобензолсульфокислоты (ДСК).

Результаты и обсуждение. При проведении морфолого-анатомического анализа лекарственного растительного сырья пижмы обыкновенной по ряду признаков были подтверждены имеющиеся литературные данные. Выявлены новые анатомо-морфологические особенности, ранее не описанные в изученной нами литературе. В качестве перспективных диагностических признаков, выявленных впервые, можно отметить:

• -    особенности строения фертильных частей трубчатого цветка пижмы, характер эпидермальных клеток завязи и ее опушения, а также строение основания завязи, заключающееся в наличии кольца склерефицированных клеток;

• -    особенности строения рыльца пестика, а именно его раздвоенность и особая неровная ворсинчатая поверхность;

• -    особенности строения андроцея, а именно пыльники, с заостренной верхушкой, сросшиеся двухгнездными теками;

• -    наличие связника, образованного клетками с сильно утолщенными лигнифицированными стенками.

Гистологические особенности строения листочков обертки : на поперечном сечении листочков обертки диагностируется мощный слой склеренхимных волокон и проводящего пучка в центральной жилке, армированного мелкими склеренхимными клетками. Гистологические особенности строения цветоложа: цветоложе выполнено основной паренхимой, при этом с периферии паренхима плотная, представлена мелкими клетками. В сердцевине цветоложа клетки паренхимы крупные, с большим количеством межклетников. Впервые в паренхиме цветоложа выявлены лизигенные вместилища, чередующиеся с проводящими элементами ксилемы. Содержимое вместилищ темнокоричневого цвета. Секрет липофильный, не растворимый в воде, хорошо растворимый в хлороформе.

Для изучения химического состава цветков пижмы обыкновенной и для препаративного выделения веществ в индивидуальном виде нами использовался метод адсорбционной колоночной хроматографии. В процессе эксперимента проводили элюирование смесью хлороформ-этиловый спирт в различных соотношениях, а затем хлороформом и смесью хлороформ-этанол в различных соотношениях, смесью вода-спирт в различных соотношениях. Эффективного разделения и очистки веществ добивались путем чередования сорбентов и соответствующих систем растворителей. Контроль за элюированием осуществляли с помощью ТСХ-анализа. Методом колоночной хроматографии из цветков пижмы обыкновенной было выделено 6 биологически активных веществ. С использованием методов 1Н-ЯМР-, УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также результатов химических превращений были установлены структуры 4 соединений: акацетин (5,7- дигидрокси-41-метокси-флавон), тилианин (7-О-в-D-глюкопиранозид акацетина), апигенин (5,7,41-тригидрокси-флавон), космосиин (7-О-в-D-глюко-пиранозид апигенина). По предварительным данным, соединения 5 и 6 отнесены нами к фенил-пропаноидам по характеру флуоресценции и характерным максимумам поглощения в УФ-спектрах. Следует отметить, что соединения тилианин и космосиин впервые выделены из цветков пижмы обыкновенной, причем тилианин является доминирующим флавоноидом данного сырья, что представляет интерес с точки зрения стандартизации.

Рис. 1. УФ-спектр спиртового раствора соединения 5

В качестве методик качественных реакций нами исследованы химические (пробирочные) реакции и ТСХ-анализ. Первоначально изучена возможность применения цианидиновой реакции на содержание флавоноидов, в результате которой наблюдается розовое окрашивание и реакция с 3% спиртовым раствором AlCl3 - усиление окрашивания. При проведении ТСХ-анализа на хроматограмме просматриваются основные вещества, выделенные из цветков пижмы обыкновенной и обнаруживающиеся в виде пятен фиолетового свечения при длине волны 254 нм. При проявлении хроматограммы раствором ДСК соединения приобретают желтую окраску. При этом доминирующий флавоноид тилианин обнаруживается с величиной Rf около 0,7 (тилианин) и величиной R около 1,2 относительно пятна ГСО цинарозида.

Рис. 2. УФ-спектр спиртового раствора соединения 6

С целью разработки методики количественного определения суммы флавоноидов в пижмы обыкновенной цветках изучены условия экстракции целевых веществ из сырья данного растения. Сырье экстрагировали 40%, 70% и 96% спиртом этиловым в соотношении сырье-экстрагент 1:30, 1:50 и 1:100 в течение 30 мин, 45 мин, 60 мин, 90 мин и 120 мин. Результаты данного исследования свидетельствуют, что оптимальными условиями экстракции сырья являются: экстрагент - 70% этиловый спирт, соотношение сырье-экстрагент - 1:50, время экстракции - 60 мин.

В ходе разработки методики изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из пижмы обыкновенной цветков. Как известно, флавоноиды образуют комплексы с алюминием хлоридом (AlCl3), что позволяет применять для оценки качества сырья метод дифференциальной спектрофотометрии в присутствии AlCl3. При разработке методики количественного определения суммы флавоноидов использовали реакцию комплексообразования с раствором алюминия хлорида для исключения вклада в значение оптической плотности других групп соединений, в частности, гидроксикоричных кислот, обуславливающих характер кривой поглощения УФ-спектра раствора извлечения из пижмы обыкновенной цветков. В этом случае наблюдается ба-тохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов, который обнаруживается в УФ-спектре в виде максимума поглощения при длине волны 400 нм (рис. 3).

Рис. 3. УФ-спектры растворов водно-спиртового извлечения из пижмы обыкновенной цветков: 1 - раствор извлечения из пижмы обыкновенной цветков; 2 - раствор извлечения из пижмы обыкновенной цветков с добавлением алюминия хлорида

Изучение УФ-спектров ГСО цинарозида показало (рис. 4), что раствор данного стандарта в присутствии алюминия хлорида имеет тот же максимум поглощения (400 нм). Следовательно, цинарозид может быть использован в методике анализа в качестве ГСО.

УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из пижмы обыкновенной цветков и ГСО цинарозида в условиях дифференциальной спектрофотометрии имеют максимум поглощения при 400 нм (рис. 5 и 6). В этой связи в качестве метода количественного анализа нами предложен метод дифференциальной спектрофотометрии с определением суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид. Использование для этих целей ГСО лютеолина, как это имеет в случае фармакопейной методики, на наш взгляд, является нецелесообразным, так как, во-первых, данный компонент практически не обнаруживается в цветках пижмы обыкновенной, а во-вторых, в сырье данного растения преобладающими компонентами являются флавоноидные гликозиды, близкие по спектральным характеристикам к цинарозиду.

Abscrtw:»

Рис. 4. Спектр спиртового раствора ГСО цинарозида:

1 - раствор ГСО цинарозида; 2 - раствор ГСО цинарозида с добавлением алюминия хлорида

Рис. 5. УФ-спектр раствора водно-спиртового извлечения из пижмы обыкновенной цветков (дифференциальный спектр) алюминия хлорида

Рис. 6. УФ-спектр раствора ГСО цинарозида (дифференциальный спектр)

В пользу выбора дифференциальной спектрофотометрии свидетельствуют также данные УФ-спектра буферного раствора спиртового извлечения пижмы обыкновенной цветков, в котором максимум поглощения составляет 350 нм, хотя аналитическая длина волны (310 нм), используемая в фармакопейной методике, приходится на минимум в кривой поглощения (рис. 7). С применением разработанных методик проанализирован ряд образцов сырья пижмы и лекарственного и показано, что содержание флавоноидов в пижме обыкновенной варьирует в пределах от 1,58% до 1,98%.

Рис. 7. УФ-спектр буферного раствора спиртового извлечения цветков пижмы обыкновенной (ГФ СССР XI издания)

Выводы:

• 1.    Анатомо-морфологическое исследование сырья пижмы обыкновенной с использованием цифровой микроскопии позволило детальным образом изучить диагностические признаки сырья данного лекарственного растения.

• 2.    Уточнены данные о химическом составе цветков пижмы обыкновенной. При этом тилианин (доминирующий флавоноид) и космосиин впервые выделены из данного сырья.

• 3.    На основе фитохимических исследований обоснованы новые подходы к оценке качества сырья пижмы обыкновенной и разработаны методики качественного анализа и количественного определения.

• 4.    Разработанные методики включены в проект нормативной документации ФС «Пижмы обыкновенной цветки» (изменение к ФС 11 «Пижмы обыкновенной цветки», ГФ XI издания, вып. 2).

• 5.    Выявленные оптимальные условия экстракции и новые подходы контроля качества цветков пижмы обыкновенной способствуют обоснования ресурсосберегающих технологий в рамках стандартизации лекарственного растительного сырья.