Оптимизация процесса иммобилизации клеток алканотрофных родококков на хвойных опилках в условиях колоночного биореактора

Метод адсорбционной иммобилизации клеток микроорганизмов широко используется в различных отраслях биотехнологии, в том числе процессах биокатализа, а также при решении экологических проблем (Козляк и др., 1991). Иммобилизованные микроорганизмы характеризуются повышенной жизнеспособностью, устойчивостью к действию неблагоприятных факторов внешней среды и высокой каталитической активностью, которая во многих случаях возрастает в несколько раз по сравнению со свободными клетками (Синицин и др., 1994). Кроме того, иммобилизация позволяет концентрировать большие количества биомассы и избегать ее значительных потерь, что важно в условиях биореактора, а также при внесении бактериальных клеток в окружающую среду (Podorozhko et al., 2008).

В настоящее время метод адсорбции используется преимущественно для иммобилизации микроорганизмов, участвующих в очистке загрязненного воздуха или сточных вод (Пирог и др., 2005). Наиболее эффективно применение адсорбированных микроорганизмов в системах биофильтров и мембранных биореакторов, предназначенных для обработки жидких и летучих промышленных отходов (Prieto et al., 2002).

Актинобактерии рода Rhodococcus широко используются в биотехнологических процессах. Родо-кокки способны синтезировать поверхностноактивные трегалозолипиды (биосурфактанты), витамины, ферменты, усваивать многие труднодоступные и токсичные для других микроорганизмов органические субстраты, расти в экстремальных условиях среды (Ившина, 1997). Представители от- дельных видов (R. erythropolis, R. ruber и R. opacus) родококков являются активными биодеструкторами нефтяных углеводородов и других ксенобиотиков (Ившина и др., 2006). Закрепление клеток родокок-ков на поверхности носителя позволит более эффективно очищать загрязненную воду от нефти и нефтепродуктов. При этом необходимым условием результативности процесса биодеструкции является достижение высокой численности иммобилизованных клеток и их прочное закрепление на поверхности носителя. В этой связи цель настоящей работы – подбор оптимального режима адсорбционной иммобилизации клеток алканотрофных родококков на органическом носителе в условиях лабораторного колоночного биореактора для последующего использования их в биотехнологии очистки нефтезагрязненной воды.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, iegmcol). Клетки родококков выращивали в 250-мл колбах Эрленмейера, содержащих 100 мл мясопептонного бульона (Oxoid Ltd, Англия) на орбитальном шейкере (160 об/мин) при 28°С в течение 24 ч. Непосредственно перед иммобилизацией бактериальные клетки отмывали от питательной среды натрийфосфатным буфером следующего состава, г/л: Na2HPO4 – 3.53; KH2PO4 – 3.39.

В качестве адсорбента клеток родококков использовали твердый органический носитель – хвойные опилки с размером частиц d = 1–3 мм. С целью повышения сродства органического материала к клеткам алканотрофных родококков и углеводородному субстрату носитель предварительно обрабатывали смесью олифы и Rhodococcus -биосурфактанта в соотношении 1:1 (Патент РФ 2298033). Непосредственно перед использованием носитель отмывали дистиллированной водой и стерилизовали автоклавированием (121^оС, 15 мин).

Процесс иммобилизации клеток родококков проводили в лабораторном колоночном биореакторе (рис. 1), представляющем собой стеклянную колонку (12.0×1.4 см), заполненную гидрофобизо-ванными опилками (2 г). Колонка соединялась при помощи силиконовых трубок с колбой, содержащей суспензию (2.0×10⁷ кл/мл; 200 мл) клеток R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249, отобранных в равном соотношении. Клеточная суспензия подавалась в колонку с помощью перистальтического насоса через нижнее входное отверстие со скоростью 0.6; 1.2; 2.0 и 2.8 мл/мин, орошала носитель в направлении снизу-вверх, вытекала из колонки через верхнее выходное отверстие и возвращалась в колбу. Таким образом, биореактор являлся замкнутой циркуляционной системой с переменной скоростью потока. Процесс иммобилизации осуществляли при комнатной температуре и контролировали путем измерения оптической плотности (ОП 600 нм ) клеточной суспензии с помощью спектрофотометра Lambda EZ 201 (Perkin Elmer, США) в течение 7 сут. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности.

Определение каталитической активности иммобилизованных клеток родококков проводили с использованием 6-канального респирометра Micro-Oxymax® (Columbus, США). Оценивали скорость дыхания (в мкл мин-1), а также количество потребленного кислорода и углекислого газа (в мкл) иммобилизованными клетками родококков в присутствии модельной нефти. В качестве модельной нефти использовали 2% водную эмульсию смеси углеводородов (н-декан, н-ундекан, н-додекан, н-тетрадекан, н-гексадекан, н-гептадекан, н-нонадекан – по 12%, пристан – 6%, нафталин, аценафтен, фенантрен, антрацен – по 2%), стабилизированную 0.1% раствором твина 60. Углеводородную эмульсию подвергали УЗ-обработке (Soniprep 150, SANYO, Япония) в течение 2 мин и вносили в колонки с иммобилизованными клетками родокок-ков и неинокулированным носителем, используемым в качестве контроля. Заполненные колонки помещали в измерительные камеры респирометра. Измерения респираторной активности проводили при 22±2оС, интервал между измерениями составлял 0.42 ч.

Результаты и их обсуждение

Анализ динамики иммобилизационного процесса в условиях колоночного биореактора (рис. 2) свидетельствует о том, что закрепление клеток ро-дококков на органическом носителе происходит наиболее интенсивно в течение первых суток эксперимента, в результате чего иммобилизуется от 18 до 36% бактериальных клеток. В дальнейшем наблюдается постепенное замедление процесса клеточной адсорбции и последующая стабилизация показателя оптической плотности суспензии на постоянном уровне, что свидетельствует о достижении уровня адсорбционного насыщения носителя. Следует отметить довольно большие величины доверительных интервалов средних значений показателя оптической плотности суспензии родо-кокков в аналогичных колонках, которые, вероятно, обусловлены неравномерностью распределения адсорбированных бактериальных клеток на поверхности носителя вследствие клеточной ко-агрегации и мозаичности распределения гидрофобных участков материала носителя (Podorozhko et al., 2008). При этом обнаруживаются существен-

Рис. 1. Колоночный биореактор (А) и экспериментальная установка (Б) по изучению процесса иммобилизации клеток родококков:

1 – подача жидкости в колонку; 2 – стеклянный фильтр; 3 – гидрофобизованные опилки с иммобилизованными клетками родококков; 4 – выход жидкости из колонки; 5 – суспензия клеток родококков; 6 – перистальтический насос; 7 – колонка

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

А

Б

В

Г

Продолжительность иммобилизации, сут

Рис. 2. Динамика процесса иммобилизации клеток родококков в колоночном биореакторе.

Скорость подачи клеточной суспензии в биореактор, мл/мин: А – 2.8; Б – 1.2; В – 0.6; Г – 2.0

ные различия в степени иммобилизации родокок-ков в зависимости от скорости подачи клеточной суспензии в биореактор. Так, наиболее высокая (57%) степень клеточной адсорбции регистрируется при скорости подачи суспензии, равной 2.0 мл/мин, в то время как соответствующие показатели при низкоскоростных (0.6 и 1.2 мл/мин) режимах работы биореактора составляют 46 и 41%, соответственно. Установлено, что дальнейшее увеличение (до 2.8 мл/мин) скорости подачи клеточной суспензии в биореактор не приводит к повышению эффективности иммобилизационного процесса. В частности, показатель оптической плотности суспензии родококков возрастает незначительно к концу наблюдения (рис. 2), что может быть обусловлено физико-химическим процессом вымывания материала носителя и биологическим процессом фрагментации клеточного мицелия при высокоскоростном режиме работы биореактора (Куюкина и др., 2007).

В результате респирометрических исследований установлено, что родококки в иммобилизованном состоянии характеризуются высокой каталитической активностью в отношении модельной нефти. Так, динамика дыхательной активности адсорбированных клеток родококков (рис. 3) характеризуется равномерным увеличением количества потребленного кислорода и выделенного углекислого газа, суммарные величины которых к концу эксперимента превышают контрольные показатели в 5 и 20 раз, соответственно. Кроме того, в условиях колоночного биореактора удельная скорость потребления О 2 иммобилизованными родококками достигает 0.6, а выделения СО 2 – 1.6 мкл/мин∙мг сухих клеток (рис. 4). Такая высокая скорость клеточного дыхания в присутствии нефтяных углеводородов поддерживается в течение 460 ч инкубирования, что свидетельствуют о функциональной стабильности иммобилизованных клеток родокок-ков и перспективности их использования для очистки нефтезагрязненной воды.

Время, ч

Рис. 3. Динамика респираторной активности иммобилизованных клеток родококков в условиях колоночного биореактора.

Варианты опыта: 1, 4 – адсорбированные клетки; 2, 3 – неинокулированный ноститель (контроль)

Рис. 4 . Скорость дыхания иммобилизованных клеток родококков в присутствии модельной нефти

Заключение

Определены оптимальные условия проведения иммобилизации клеток алканотрофных родокок-ков на гидрофобизованных древесных опилках в условиях лабораторного колоночного биореактора. Установлено, что данный процесс при заданном режиме (2.0 мл/мин) подачи клеточной суспензии в биореактор и концентрации клеток (2.0×107 кл/мл) завершается на 5-е сутки и характеризуется высокой (57%) степенью иммобилизации родокок-ков на органическом носителе. Посредством респирометрии показано, что родококки в иммобилизованном состоянии проявляют стабильно высокую каталитическую активность в отношении нефтяных углеводородов, поддерживаемую в течение трех недель. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности использования иммобилизованных клеток родококков в биотехнологическом процессе очистки нефтезагрязненной воды и перспективности осуществления данного процесса в колоночном биореакторе.

Исследование выполнено при поддержке грантов ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. и программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».