Оптимизация процесса криоконсервации спермы осетровых рыб при использовании различных сред

Криоконсервация остается одним из наиболее эффективных и быстроразви-вающихся направлений сохранения редких и исчезающих видов. Наличие в криобанке генетически репрезентативных коллекций геномов рыб из маточных стад на осетровых рыбоводных заводах и из естественных популяций позволяет с максимальным эффектом сохранить генетическое разнообразие этих ценных промысловых объектов. В последнее время широкое применение получили проникающие криопротекторы, которые являются наиболее эффективными в сравнении с непроникающими, но и они оказывают повреждающее действие в цикле криоконсервирования, и даже на этапе подготовки к замораживанию. Причиной этого является то, что протекторы неиндифферентны по отношению к клеткам. Криопротекторы оказывают воздействие на физико-химические и функциональные свойства цитоплазматических и митохондриальных мембран спермиев, изменяют активность ферментов [3]. Установлено, что после замораживания в мембране митохондрий развивается перекисное окисление полиненасыщенных кислот

в β-положении фосфолипидных молекул, что приводит к нарушению структуры клеточных мембран. Развитие этого процесса характерно как для внутренней мембраны митохондрий, так и для целых органелл. Снижение содержания фосфолипидов сопровождается ослаблением гидрофобных липид-липидных и липид-белковых связей в мембране. Появление перекисных группировок в мембране вызывает в первую очередь резкое уменьшение связывания липидов с белками, что ведет к существенным изменениям каталитических свойств ферментов и подавлению функциональной активности митохондрий [1].

Основной задачей наших исследований явилась оптимизация процесса криоконсервации спермы рыб методом подбора оптимальных криопротекторов и снижения их негативного воздействия на клетки.

Материалом для исследования служила сперма русского осетра, полученная на осетровых рыбоводных заводах Нижней Волги: Бертюльский, Лебяжий, Сергиевский. Исследования проводились в 2005-2008 гг. Получение спермы осуществляли методом гипофизарных инъекций. Активность половых клеток определяли по 5-ти бальной шкале Г.М. Персова [4]. В исследованиях по криоконсервации использовали сперму активностью 4 и 5 баллов. В качестве криопротекторов использовали среду Штайна (NaCl, KCl, NaHCO 3 , глюкозы, 12,5% яичного желтка, 12,5% ДМСО) и разработанную нами криосреду

№ 3 (NaCl, KCl, NaHCO 3 , CaCl 2 , маннит, сахароза, 10% яичного желтка, 10% ДМСО). Замораживание проводили по методике [6].

Об интенсивности пероксидного окисления липидов (ПОЛ) спермы судили по накоплению одного из конечных продуктов – малонового диальдегида (МДА), реагирующего с тиобарбитуровой кислотой по стандартной методике [5]. Расчет проводили по формуле:

Х=(Е*3*3,2) / (0,156*2), где Х – содержание малонового диальдегида в сперме, нмоль; Е – экстинкция проб; 3,2 – общий объем исследуемых проб, мл; 2 – объем надосадочной жидкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл; 3 – объем проб, мл; 0,156 – экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм.

Исследование активности сперматозоидов осуществляли на трех этапах: нативная сперма, после эквилибрации, деф-ростированная сперма. Выживаемость сперматозоидов в процессе криоконсервации постепенно снижается, причем в среде Штайна отмечается меньшее количество живых клеток после дефростации по сравнению с криосредой № 3 (рис. 1).

Рис. 1. Выживаемость спермы русского осетра в разных средах

Криопротекторы в той или иной степени оказывают токсическое действие на клетки при проникновении внутрь. В связи с этим после двойного температурного шока токсическое действие протектора может иметь решающее значение при восстановлении клетками процессов дыхания и метаболизма. Нами отмечен латентный период активности сперматозоидов после оттаивания, они начинают проявлять признаки жизни лишь через 30-40 секунд после активации водой, что может быть связано с отрицательным действием протекторов.

Для установления токсического воздействия протектора на сперму русского осетра проводили опыты по определению пероксидного окисления липидов до замораживания, и после дефростации материла (рис. 2). Увеличение скорости процесса ПОЛ спермы способствует повреждению мембран, что приводит к снижению смачиваемости сперматозоидов и вследствие этого к уменьшению подвижности, аномальному строению, потере жизнеспособности [7].

Полученные результаты свидетельствуют о возрастании уровня пероксидного окисления липидов спермы на исследуемых этапах криоконсервации как со средой Штайна, так и с криосредой №3, что согласуется с литературными данными о возрастании скорости ПОЛ после замораживания [2]. Установлено усиление ПОЛ спермы при криоконсервации с криосредами, несмотря на то, что один из компонентов сред – желток куриного яйца стабилизирует клеточные мембраны входящими в его состав фосфолипидами. Следует отметить, что в криосреде №3 скорость накопления МДА на всех этапах меньше, чем в среде Штайна. В связи с этим, целесообразно рассматривать добавление антиоксидантов в криосреды. Известны примеры использования синтетических жирорастворимых антиоксидантов фенольного ряда в качестве криопротекторов спермы сельскохозяйственных животных [2].

В результате проведенных экспериментов установлено, что выживаемость сперматозоидов с поступательным движением на всех этапах процесса замораживания-оттаивания выше в криосреде № 3 по сравнению со средой Штайна. Так, после эквилибрации количество активных сперматозоидов составляет 90% и 50%, а после дефростации – 60% и 10%, соответственно. Это обусловлено более интенсивным процессом ПОЛ спермы русского осетра во время криоконсервации при использовании среды Штайна. Содержание малонового диальдегида в варианте со средой Штайна по сравнению с криосредой № 3 в 1,6 раза выше после эквилибрации и в 2,4 раза выше после дефростации.

Рис. 2. Изменение уровня пероксидного окисления липидов спермы русского осетра до и после криоконсервации