Оптимизация способа выращивания перевиваемой линии клеток КПНК

Культуры клеток животных стали неотъемлемой частью биотехнологии, они используются для решения научных проблем общей биологии, цитологии, генетики, вирусологии, иммунологии и инфекционной патологии.

Дело в том, что культура клеток in vitro – это динамичная система взаимодействующих составляющих элементов (клеток), которые находятся в постоянном размножении, развитии, отмирании. Создание оптимальных условий жизнедеятельности клеток вне организма – одна из основных проблем клеточной биотехнологии.

Клеточные культуры служили весьма информативными лабораторными моделями для скрининга лекарственных препаратов. Достижения последних лет в области молекулярной и клеточной биологии, иммунологии определили основные направления по созданию новых препаратов.

Сохранение и развитие уникальной Коллекции культур клеток имеет большое научное и народнохозяйственное значение как для исследований биологии клетки в культуре, вирусологии, иммунологии и биотехнологии.

Развитие важнейших и наиболее перспективных современных направлений фундаментальных и прикладных исследований в области биологии, медицины и ветеринарной медицины, а так же создания новых биомедицинских технологий невозможно без широкого использования культур клеток человека, животных.

СО 2 является компонентом воздуха и вовлечен в многочисленные биохимические реакции, происходящие в клетке. Изменение концентрации СО 2 может оказывать существенное воздействие на процессы роста клеточных линий. В процессе культивирования клеток животных in vitro в лабораторных условиях часто используют 5 % содержание углекислого газа в атмосфере инкубатора. Некоторые исследователи отмечают благоприятное воздействие относительно высоких концентраций СО₂ (от 5 до 10%) на развитие 8- клеточного зародыша хомячка in vitro [2]. В то же время показано, что 100% СО 2 уменьшает рост и стимулирует апоптоз клеток рака яичников человека линий НО8910 и SKOV3, как и других опухолевых клеток [1, 3, 5]. Стимулирующее влияние СО₂ в концентрации 5-7% на пролиферативную активность перевиваемых культур клеток LEK и ВНК полученных соответственно, из легкого эмбриона крупного рогатого скота и почек сирийского хомячка было показано ранее [6].

Материалы и методы.

Перевиваемую линию клеток почек новорожденных крольчат (КПНК) культивировали монослойно в стандартных условиях [4] в присутствии 5 и 7% концентрации СО 2 . Контролем служила культура, выращенная в термостате без доступа СО 2 . Индекс пролиферации (ИП) и количество митозов определяли через 72 ч культивирования, для чего клеточный монослой снимали раствором трипсина с версеном и клетки считали в камере Горяева. Индекс пролиферации определяли по формуле ИП=X\Y*2200, где Y-количество засеянных клеток, а Х- общее количество выросших клеток, 2200-степень разведения. Статистическую обработку проводили по критерию Вилькоксона.

Результаты исследований . В результате проведенных исследований установлено, что через 72ч роста ИП в контрольной культуре клеток равнялся 3,2 ± 0,3, а при культивировании в условиях 5 % и 7% концентрации СО 2 - 3,5 ± 0,3 (р≤0,001) и 3,7 ± 0,3 (р≤0,001) соответственно. Количество митозов при культивировании КПНК в контрольных условиях и 5 % СО₂ существенно не различалось, равнялось 27 ± 0,6 % и 29 ± 1,2 % , соответственно. При культивировании в условиях 7 % СО₂ количество митозов было достоверно больше и соответствовало 37 ± 1,0% (р≤0,05).

Зависимость митотического деления и скорости роста перевиваемой линий клеток КПНК от концентрации СО 2 иллюстрируется рисунками 1,2.

Из представленных рисунков видно, что 5% и 7%-ные концентрации углекислого газа оказывают стимулирующее действие на рост перевиваемой линии клеток КПНК. Наибольшее количество митозов выявлено при культивировании КПНК в атмосфере с 7% СО 2 . Вероятно, это связано с тем, что в условиях легкой гипоксии увеличивается длительность фазы логарифмического роста по сравнению с контролем и в присутствии 5 % СО 2 .

Рисунок 1 - Индекс пролиферации перевиваемой линии КПНК через 72 ч культивирования.

Рисунок 2 - Митотический индекс перевиваемой культуры клеток КПНК через 72 ч культивирования

Влияние температурного режима культивирования клеток КПНК на пролиферативную активность изучали в диапазоне температур от 36 до 39ºС (табл.).

Температура культивирования (ºС)

36,0±0,5

37,0±0,5 38,0±0,5 39,0±0,5

Оптимальной температурой культивирования для линии клеток КПНК определена 37,0±0,5 °С, так как при увеличении или уменьшении данного технологического параметра происходит замедление скорости роста клеточной популяции.

Таблица - Влияние температуры культивирования на пролиферативную активность линии клеток КПНК при посевной концентрации (3-4×105кл/мл).

ИП

1,3±0,07

2,1±0,09

1,8±0,09

1,5±0,11

Отклонение выше перечисленных условий культивирования в ту или иную сторону приводило к снижению пролиферативной активности клеточной популяции, а также к морфологическим изменениям клеток – возрастало количество вакуолизированных и мертвых клеток.

Выводы. Таким образом, 5% и 7% концентрации углекислого газа оказывают стимулирующее действие на рост перевиваемой линии клеток КПНК. Наибольшее количество митозов выявлено при культивировании КПНК в атмосфере с 7% СО₂. Перспектива использования полученной культуры клеток КПНК заключается в возможности замены данной линии в качестве биологического субстрата для выращивания вирусов с более высоким выходом вирусной массы, что делает производство вирус-вакцинных препаратов более экономичным. На применение разработанной нами клеточной линии новорожденных крольчат (КПНК) получен патент №2520868 от 28 апреля 2014г.

Plotnikova E.M., Khaziev L.R. Summary

Change of СO 2 concentration affects on cellular growth process. 5 % and 7 % СО 2 concentration has a favorable effect on growth of newborn rabbit kidney cell line. The mitosis largest number was revealed in cells cultured in an atmosphere containing 7 % СО₂.