Оптимизация среды культивирования амидазосодержащих бактерий

ем R -продукта [Nojiri, Taoka, Yasohara, 2014]. Ацилтрансферазная активность амидаз требуется главным образом для синтеза востребованных в фармацевтической промышленности гидроксамовых кислот [Fournand, Bigey, Arnaud, 1998; Bhatia et al., 2014].

Одним из путей получения больших количеств высокоактивной амидазы является клонирование и сверхэкспрессия гена этого фермента, как это было сделано для гена энантиоселективной амидазы из Klebsiella oxytoca KCTC 1686, клонированного в Escherichia coli [Guo et al., 2015], для трех амидаз семейства сигнатурных амидаз ("signature amidase" ) из Delftia tsuruhatensis ZJB-05174, гены которых были клонированы в E. coli JM109 [Wu, Zheng, Zheng, 2016], для гена амидазы Parvibaculum lavamentivorans ZJB14001, клонированного в E. coli BL21 [Wu, Zheng, Zheng, 2017], однако до сих пор наиболее распространенной остается традиционная технология скрининга природных источников с последующей селекцией активных штаммов микроорганизмов и подбором условий их выращивания. Для получения активного биокатализатора необходима разработка и оптимизация сред культивирования. В случае минеральной синтетической среды важен обоснованный выбор предпочтительных источников углерода и азота, при введении которых в среду будет получена максимально возможная биомасса с требуемой ферментативной активностью. Для Alcaligenes de-nitrificans – нитрилутилизирующих бактерий с нитрилазной активностью, оптимизированная среда культивирования включала 10 г/л ацетата аммония в качестве источника углерода и азота и кукурузный экстракт в качестве питательной добавки [Полтавская и др., 2004]. При промышленном производстве штамма-продуцента высокоактивной нитрилгидратазы Rhodococcus rhodochrous M33 двустадийная система культивирования на глюкозе и ацетате позволила получить биокатализатор с активностью свыше 5000 ед/мл [Дебабов, Яненко, 2011]. Бактериальные клетки с активной амидазой также являются перспективным биокатализатором, что обусловливает интерес к поиску новых штаммов и интенсификации процесса их выращивания.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилась оптимизация по углеродному субстрату минеральной среды культивирования штаммов грамотрицательных бактерий, обладающих амидазной активностью.

Материалы и методы исследования

Штаммы грамотрицательных бактерий A. guillouiae 11h, P. monteilii 5, A. faecalis 2, изолированные из активного ила биологических очистных сооружений г. Перми [Демаков и др., 2015], культивировали на жидкой минеральной среде, содержащей (г/л): KH 2 PO 4 – 1.0; K 2 HPO 4 ×3H 2 O – 1.6; NaCl – 0.5; MgSO 4 ×7H 2 O – 0.5, CaCl 2 – 0.005; FeSO 4 ×7H 2 O – 0.01;

FeSO 4 ×7H 2 O – 0.01; CoCl 2 ×6H 2 O – 0.01, рН 7.2±0.2. Оптимизацию ростовой среды проводили по источнику углерода. В среду асептически добавляли один из источников углерода: глюкозу, сахарозу, ацетамид, ацетат натрия в концентрации 0.025, 0.05, 0.1, 0.5, 1 М. Ацетамид являлся также и источником азота, в остальных случаях таковым служил 0.01 М хлорид аммония.

Культивирование проводили в колбах Эрлен-мейера объемом 100 мл в 20 мл минеральной среды в течение 7 дней при температуре 25ºС на шейкере со скоростью перемешивания 140 об/мин.

Биомассу центрифугировали 10 мин при 13 000 об/мин, высушивали до постоянного веса, взвешивали на аналитических весах и определяли урожай клеток, который выражали в мг АСБ/мл.

Реакцию трансформации 100 мМ раствора акриламида проводили в калий-фосфатном буфере (рН 7.2±0.2) в течение 1 ч при 25ºС, реакцию останавливали добавлением концентрированной HCl до конечной концентрации 5%. Концентрацию акриловой кислоты в реакционной смеси определяли методом ВЭЖХ [Максимова и др., 2015]. Амидазную активность выражали в мкмоль/мг/мин.

Экономический коэффициент потребления субстрата рассчитывали по формуле: Y = X/C, где Y – экономический коэффициент, X – количество образовавшейся биомассы (масса сухих клеток в мг), C – количество потребленного субстрата в мг [Ждан-Пушкина, 1983].

Кривую роста A. faecalis 2 снимали на планшетном ридере Tecan Infinite M1000 (Tecan, Швейцария) при культивировании на жидкой минеральной среде с 0.025, 0.05, 0.1, 0.5 М ацетамидом в 24-луночном полистероловом планшете (Eppendorf) в течение 76 ч.

Статистическая обработка результатов выполнена с помощью пакета программ Microsoft Excel 2008. Результаты представлены как среднее значение не менее чем трех независимых экспериментов ± стандартная ошибка среднего (M±m, n=3–4).

Результаты и их обсуждение

Рост A. guillouiae 11h и A. faecalis 2 наблюдали только на среде с ацетамидом и ацетатом натрия, на глюкозе и сахарозе данные штаммы не росли. Определены урожай, амидазная активность и экономический коэффициент потребления субстрата при росте A. guillouiae 11h и A. faecalis 2 на ацетамиде как наилучшем субстрате роста для этих штаммов (таблица). Показано, что наибольшая активность наблюдается у клеток A. guillouiae 11h, выращенных на 0.025 М ацетамиде (рис. 1) и у A. faecalis 2 на 0.1 М ацетамиде (рис. 2). При этом максимальный урожай был получен при росте A. guillouiae 11h и A. faecalis 2 на среде с 0.5 М ацетамидом. Однако экономический коэффициент потребления субстрата при росте на 0.5 М ацетамиде был невысок и составлял 13 и 22% для A. guillouiae 11h и A. faecalis 2 соответственно.

Нами была показана обратная зависимость между урожаем и амидазной активностью A. guillouiae 11h и A. faecalis 2, что может быть связано со снижением экспрессии оперона, кодирующего нитрилгидратазу и амидазу, в условиях активного роста. Эти данные согласуются с результатами, полученными при оптимизации среды культивирования амидазосодержащего штамма Geobacillus subterraneus RL-2a, когда при росте на сахарозе, крахмале, фруктозе, мальтозе, галактозе, маннитоле повышенный урожай биомассы сочетался со снижением амидазной активности, а арабиноза, ацетат и цитрат натрия в среде культивирования приводили к повышению амидазной активности штамма в сочетании с низким урожаем [Mehta et al., 2016].

P. monteilii 5 использовал как источник энергии простые сахара, ацетамид и ацетат натрия. Показано, что в данном случае оптимальным источником углерода являлась глюкоза в концентрации 0.025 М, при которой урожай и активность были сопоставимы, а экономический коэффициент наибольший (рис. 3). Только при росте P. monteilii 5 на 0.5 и 1 М ацетамиде наблюдали амидазную активность, на порядок и более превышающую таковую при росте на глюкозе, но в данном случае экономический коэффициент потребления субстрата был очень мал (таблица).

Изучали динамику роста A. faecalis 2 на ацетамиде в различных концентрациях. Было показано, что 0.05 М ацетамид обеспечивал наибольший прирост биомассы с лаг-фазой, составляющей 10 ч, и длительной логарифмической фазой, наблюдавшейся до 50 ч роста, после чего происходило постепенное снижение оптической плотности (рис. 4). Скорость роста в лог-фазе составляла 0.019 ч-1. При росте на 0.1 М ацетамиде лог-фаза была более короткая – 10 ч со скоростью роста 0.033 ч-1. После 26 ч роста оптическая плотность медленно нарастала, при этом скорость роста составила 0.007

ч-1. Концентрация ацетамида 0.025 М была недостаточной для интенсивного роста бактерий, а 0.5 М – ингибирующей.

Концентрация ацетамида, М

Рис. 1 . Зависимость урожая биомассы (1) и амидазной активности (2) A. guillouiae 11h от концентрации ацетамида в среде культивирования

Рис. 2 . Зависимость урожая биомассы (1) и амидазной активности (2) A. faecalis 2 от концентрации ацетамида в среде культивирования

Ростовые характеристики и амидазная активность штаммов в зависимости от источника углерода в среде культивирования

Источник углерода, М

Урожай, мг/мл

Экономический коэффициент потребления субстрата, %

Амидазная активность, мкмоль/мг/мин

A. guillouiae 11h, рост на ацетамиде

0.025	0.52±0.13	38.3±15.9	0.263±0.019
0.050	0.54±0.05	19.0±3.1	0.191±0.020
0.100	1.14±0.19	20.5±5.8	0.103±0.000
0.500	3.78±0.29	13.1±1.2	0.024±0.002
1.000	1.74±0.15	2.9±0.4	0.138±0.001

P. monteilii 5, рост на глюкозе

0.025	0.98±0.33	21.7±7.2	0.060±0.030
0.050	0.70±0.20	7.8±2.2	0.041±0.006
0.100	0.65±0.10	3.6±0.6	0.031±0.002
0.500	1.63±0.08	1.8±0.1	0.040±0.003
1.000	1.63±0.08	0.9±0.0	0.041±0.004

Окончание таблицы

Источник углерода, М

Урожай, мг/мл

Экономический коэффициент потребления субстрата, %

Амидазная активность, мкмоль/мг/мин

P. monteilii 5, рост на ацетамиде

0.500	0.45±0.15	1.5±0.5	1.041±0.022
1.000	1.63±0.03	2.8±0.0	0.608±0.050

A. faecalis 2, рост на ацетамиде

0.025	2.23±0.20	150.8±13.4	0.018±0.003
0.050	2.08±0.72	70.3±24.4	0.056±0.005
0.100	3.28±0.11	55.5±1.9	0.128±0.005
0.500	6.53±0.97	22.1±3.3	0.053±0.015
1.000	3.28±0.96	5.6±1.6	0.015±0.002

Рис. 3 . Зависимость урожая биомассы (1) и амидазной активности (2) P. monteilii 5 от концентрации глюкозы в среде культивирования

Время, ч

Рис. 4 . Рост A. faecalis 2 на жидкой минеральной среде с ацетамидом

По данным научной литературы, амидазы могут быть как конститутивными [Egorova et al., 2004; Prasad, Sharma, Bhalla, 2005], так и индуци-бельными ферментами [Sharma, Sharma, Bhalla, 2009], причем в качестве индукторов могут выступать акриламид, ацетамид, изобутирамид, кето-профенамид, пропионамид и некоторые нитрилы. Нами было показано, что для проявления амидазной активности штаммов A. faecalis 2, A. guillouiae 11h и P. monteilii 5 необходимо присутствие ацетамида в ростовой среде, который является одновременно и субстратом роста, и индуктором. Данный факт подтверждает индуцибельный характер амидазной активности изученных штаммов. По совокупности ростовых характеристик, включающих урожай, активность амидазы и экономический коэффициент потребления субстрата, оптимальной концентрацией ацетамида для A. guillouiae 11h является 0.025 М, для A. faecalis 2 – 0.1М.

Заключение

Таким образом, максимальная биомасса (2.08– 6.53 мг/мл) была получена при росте A. faecalis 2 на 0.025–1 М ацетамиде, максимальная амидазная активность (0.6–1 мкмоль/мг/мин) при росте P. monteilii 5 на 0.5–1 М ацетамиде, наилучшие показатели экономического коэффициента (55.5– 150.8%) при росте A. faecalis 2 на 0.025–0.1 М ацетамиде. По литературным данным, активность ациламидазы из Rhodococcus erythropolis ТА37 по акриламиду составляла 0.35 мкмоль/мг/мин [Лавров и др., 2010], максимальная амидазная активность G. subterraneus RL-2a на оптимизированной среде – 0.6 мкмоль/мг/мин [Mehta et al., 2016], амидазная активность рекомбинантного штамма E. coli JM109 по акриламиду – 3.7 мкмоль/мг/мин [Wu, Zheng, Zheng, 2016]. Следовательно, изученные нами штаммы не уступают описанным аналогам и имеют перспективу использования как для биокаталитических целей, так и для целей биодеградации и очистки окружающей среды.

A. guillouiae и A. faecalis по российской классификации (СП 1.3.3118-13) не входят в группу опасных патогенов, но по европейской классификации (2000/54/ЕС) относятся к группе риска 2, что накладывает некоторые ограничения на практическое использование этих штаммов и требует в дальнейшем проведения тестов, доказывающих отсутствие у них вирулентности.