Оптимизация условий биосинтеза-маннаназы грибного происхождения

Ключевы е слова: β-маннаназа, наименьших квадратов.

β-Μаннаназа (ЕС 3.2.1.78) - фермент, относящийся к классу О-гликозид-гидролаз, расщепляет внутренние β-1,4-гликозидные связи в маннанах, являющихся полимерами клеточной стенки многих растений. Продуктами их ферментативного гидролиза являются манноза и низкомолекулярные манноолигосахариды, которые обладают выраженным пребиотическим и иммуностимулирующим действием [1, 2, 3].

В настоящее время β-маннаназы стали объектом повышенного внимания в связи с перспективами их применения в различных отраслях промышленности, в частности, при производстве биофармацевтических препаратов для ветеринарии и использования в качестве биодобавки в кормопроизводстве [4, 5].

При промышленном производстве ферментных препаратов высокая стоимость питательной среды неизбежно приводит к удорожанию целев ого продукта, поэтому использование органических источников питания среды, являющихся относительно дешевым и доступным сырьем, будет положительно сказываться на рентабельности производства.

Черняева С.Н., Корнеева О.С., 2013

активность, удельные энергозатраты, метод

В предыдущих работах для глубинного культивирования микроскопического гриба Trichoderma harzianum в качестве источников азотного и углеродного питания были предложены NaNO 3 (0.1 % по азоту) и 4 % фруктозы соответственно. Активность β-маннаназы составила 210 ед/мл [6].

Использование для биосинтеза β-маннаназы органических источников азота и углерода представляет экономический интерес, поскольку эти компоненты являются относительно дешевым и доступным сырьем, что немаловажно для рентабельности промышленного производства ферментного препарата.

Целью данной работы было проведение оптимизации состава питательной среды для глубинного культивирования микро-мицета Trichoderma harzianum с целью повышения биосинтеза им β-маннаназы и снижения удельных энергозатрат на процесс культивирования.

Культивирование продуцента осуществляли глубинным способом в ферментере вместимостью 100 л (ООО – фирма «Про-интех») на питательной среде Чапека в течение 72 ч при температуре 30-32 °С, в качестве источника углерода вносили кукурузную му- ку, в качестве источника азота – белково-витаминный концентрат. Условия культивирования продуцента и органические источники азота и углерода были выбраны в ходе ранее проведенных исследований [7].

Определение активности β-маннаназы проводили методом Сомоджи-Heльсона. В качестве субстрата использовали галактоманнан LBG (камедь рожкового дерева). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое при гидролизе галактоманнана образует 1 ммоль маннозы за одну минуту в ацетатном буфере рН 4,5 при 60 °С [8, 9].

Оптимизацию условий биосинтеза проводили с применением методов математического моделирования: построение адекватной математической модели процесса методом наименьших квадратов с последующим статистическим анализом результатов; нахождение оптимальных условий биосинтеза фермента и энергозатрат процесса.

Программа исследований закладывалась в экспериментальную матрицу, включающую 32 отдельных опыта. Для получения простейшей адекватной модели требовалось связать выходные параметры системы (β-маннаназная активность, удельные энергозатраты) с входными - условиями культивирования и концентрацией компон ентов среды.

В качестве основных факторов, влияющих на биосинтез β-маннаназы T.harzianum , были взяты: X 1 – температура культивирования, ⁰С; X 2 – рН среды; Х 3 - продолжительность культивир ования ч.; X 4 –концентрация источника углерода (кукурузная мука), %; X 5 –концентрация источника азота белково-витаминный (БВК), %. Все эти факторы совместимы и некоррелируемы между собой. Пределы изменения исследуемых факторов приведены в таблице 1.

Таблица 1

Пределы изменения факторов при биосинтезе β-маннаназы T.harzianum

Условия планирования	Кодированное значение	Значения факторов
		Х 1	Х 2	Х 3	Х 4	Х 5
		Т, °С	pΗ	τ, ч.	С к.м. , %	С бвк , %
Основной уровень	0	32	4	72	4	0,2
Интервал варьирования	Δ	6	1	12	1	0,1
Верхний уровень	+1	38	5	84	5	0,3
Нижний уровень	-1	26	3	60	3	0,1

1	2	3	4	5	6	7	8
11	413,8	436,9	418,3	534,9	540,5	468,9	0,219
12	413,8	397,5	418,3	534,9	422,3	437,5	0,217
13	384,5	436,9	415,0	534,9	540,5	462,3	0,227
14	384,5	397,5	415,0	534,9	422,3	430,8	0,225
15	413,8	436,9	415,0	534,9	422,3	427,9	0,232
16	413,8	397,5	415,0	534,9	540,5	460,5	0,234
17	239,8	563,0	563,0	523,6	563,0	490,5	0,213
18	198,2	563,0	563,0	523,6	563,0	481,9	0,219
19	563,0	280,4	563,0	523,6	563,0	498,8	0,215
20	563,0	297,8	563,0	523,6	563,0	502,2	0,217
21	563,0	563,0	354,7	523,6	563,0	513,5	0,202
22	563,0	563,0	316,4	523,6	563,0	505,6	0,231
23	563,0	563,0	563,0	246,6	563,0	500,0	0,206
24	563,0	563,0	563,0	563,0	563,0	557,4	0,223
25	563,0	563,0	563,0	523,6	232,5	489,0	0,213
26	563,0	563,0	563,0	523,6	507,3	543,8	0,217
27	563,0	563,0	563,0	523,6	563,0	563,0	0,216
28	563,0	563,0	563,0	523,6	563,0	564,0	0,216
29	563,0	563,0	563,0	523,6	563,0	563,0	0,216
30	563,0	563,0	563,0	523,6	563,0	563,0	0,216
31	563,0	563,0	563,0	523,6	563,0	563,0	0,216
32	563,0	563,0	563,0	523,6	563,0	562,0	0,216

Критериями оценки влияния различных факторов на биосинтез β-маннаназы была активность в глубинной культуре (Y 1 , ед/мл) и удельные энергозатраты процесса культивирования (Y 2 , кВт·ч/л).

Оптимизация условий культивирования продуцента заключалась в подборе таких тех-

нологических режимов, при которых величина β-маннаназной активности была бы максимальной, а удельные затраты процесса культивирования минимальными.

Экспериментальная матрица включала в себя 32 различных эксперимента (таблица 2).

Т а б л и ц а 2

Матрица экспериментальных данных

Опыты	Кодированные значения факторов					Y 1 , ед/мл	Y 2 , кВт·ч/л
	X 1	X 2	X 3	X 4	X 5
1	2	3	4	5	6	7	8
1	384,5	436,9	418,3	384,0	540,5	432,8	0,202
2	384,5	397,5	418,3	384,0	422,3	401,3	0,204
3	413,8	436,9	418,3	384,0	422,3	415,0	0,208
4	413,8	397,5	418,3	384,0	422,3	409,5	0,208
5	384,5	436,9	415,0	384,0	422,3	408,5	0,216
6	384,5	397,5	415,0	384,0	540,5	424,3	0,218
7	413,8	436,9	415,0	384,0	540,5	438,0	0,225
8	413,8	397,5	415,0	384,0	422,3	409,3	0,223
9	384,5	436,9	418,3	534,9	422,3	439,4	0,210
10	384,5	397,5	418,3	534,9	540,5	455,1	0,213

Проверка показала, что экспериментальные данные являются нормально распределенными и однородными.

Коэффициенты уравнений регрессии вычисляются по методу наименьших квадратов в матричном виде, поэтому необходимо отметить, что экспериментальные данные должны быть однородными и нормально распределенными. Коэффициенты уравнений регрессии определялись по формуле:

b = ( ф T ф ) - 1 -ф T Y

риментов, число столбцов равно числу функций модели;

Y = { у^э э ^ксп } - столбец выходных параметров; b = { b u } — столбец искомых коэффициентов. Для определения коэффициентов взаимодействия необходимо расширить таблицу 2 дополнительными столбцами, учитывающими эффект двойного и квадратичного взаимодействия факторов. Будем рассматривать уравнения регрессии в виде:

где Ф = {Ф „ } = {f u ( X i )} - регрессионная матрица. Число строк матрицы равно числу экспе-

Y = b 0 +b 1 x 1 +b 2 x 2 +b 3 x 3 +b 4 x 4 +b 5 x 5 +b 6 x 1 x 2 +b 7 x 1 x 3 +b 8 x 1 x 4 +b 9 x 1 x 5 +b 10 x 2 x 3 +b 11 x 2 x 4 + +b 12 x 2 x 5 +b 13 x 3 x 4 +b 14 x 3 x 5 +b 15 x 4 x 5 +b 16 х 1 ²+b 17 х 2 ²+b 18 х 3 ²+b 19 х 4 ²+b 20 х 5 ²                         (2)

Эффекты взаимодействия определяли аналогично линейным эффектам. В соответствии с данными таблицы 2 рассчитывали коэффициенты уравнения регрессии. Величина коэффициента регрессии (bi) характеризует вклад каждого фактора (Хі) условия биосинтеза в значения уровня β-маннаназной активности и энергозатрат (Үі).

Полученные уравнения регрессии имели следующий вид:

• Y 1 = -121,3-0,14 х 1 -0,2х 2 +0,82х 3 +1,5х 4 -0,4х 5 -8,1·10^-5х 1 х 2 +2,24·10^-4х 1 х 3 -1,15·10^-3х 1 х 4 + +1,5·10^-3х 1 х 5 +2,9·10^-4х 2 х 3 -5,3·10^-4х 2 х 4 +1,8·10^-3х 2 х 5 +7,5·10^-4х 3 х 4 -2,4·10^-3х 3 х 5 +2,6·10^-4х 4 х 5 + +4,6·10^-5х 1 ²-9,3·10^-5х 2 ²+9,5·10^-5х 3 ²-1,2·10^-3х 4 ²+4,3·10^-4х 5 ²                                         (3)

• Y 2 = 2,33+2,97·10^-4х 1 -3,01·10^-4х 2 -8,7·10^-3х 3 -4,9·10^-4х 4 +2,8·10^-4х 5 -4,9·10^-6х 1 х 2 +2,6·10^-6х 1 х 3 -

• - 5,2·10^-7х 1 х 4 +1,24·10^-6х 1 х 5 +6,3·10^-6х 2 х 3 +4,9·10^-7х 2 х 4 -1,24·10^-6х 2 х 5 +5,7·10^-7х 3 х 4 -2,6·10^-7х 3 х 5 -

• - 2,2·10^-7х 4 х 5 +7,7·10^-7х 1 ²-1,9·10^-9х 2 ²+3,9·10^-6х 3 ²+4,5 10^-7х 4 ²-1,8·10^-8х 5 ²                           (4)

Значимость коэффициентов регрессии проверяли по критерию Стьюдента. В результате проверки все критерии следует признать значимыми. Вычисляли значение остаточной дисперсии, которая определяет величину разброса выходных параметров y под действием случайных помех:

N

2                        выч эксп 2

S _ост = _N - _k ∑ = ( y _i - y _i ) ,       (5)

где k – число коэффициентов модели.

Вычисленная остаточная дисперсия для обеих моделей составила:

S 1ost =9.025, S 2ost =3,481×10^-5                    (6)

Значения диспресии свидетельствуют о том, что данные, полученные по модели, практически не расходятся с экспериментальными данными.

Проверку эффективности полученной модели проводили с использованием F-критерия Фишера. Вычисленное значение F было больше табличного, что доказывает эффективность полученной модели.

По построенным моделям найдем значения переменных x i , i= 1,5 , при которых удельные энергозатраты процесса культивирования будут минимальными, а активность фермента β-маннаназы будут максимальными, т. е. необходимо решить задачу оптимизации двух критериев:

• Y 2 → max,

• Y 1 → min.

Введем линейную свертку критериев:

Q = Y2 – Y1 → max             (7)

С помощью математических расчетов в MathCAD были найдены оптимальные значения условий биосинтеза фермента и удельных энергозатраты процесса (таблица 3).

Т а б л и ц а 3

Оптимальные условия культивирования продуцента

Факторы биосинтеза	Оптимальные значения факторов
Температура,°С	32
рН среды	4
Продолжительность культивирования, ч.	72
Концентрация источника углерода, %	3,7
Концентрация источника азота, %	0,2

Для подтверждения достигнутых результатов проведен контрольный эксперимент: при исходных условиях культивирования и оптимальных, подтвердивший эффективность оптимизации на основе математического моделирования эксперимента методом наименьших квадратов.

При оптимальных условиях β-маннаназная активность выросла в 2,7 раза и составила 564,0 ед/мл, а удельные энергозатраты снизились по сравнению с затратами на процесс культивирования на контрольной среде на 10 %, что является более выгодным с экономической точки зрения.