Оптимизация условий получения лизинсодержащего концентрата кормового назначения на обогащенной лизином основе
Автор: Лушников А.В., Гнеушева И.А., Солохина И.Ю., Горькова И.В., Ярославкина Н.Ю., Воронкова М.В., Ермакова Н.В.
Журнал: Биология в сельском хозяйстве @biology-in-agriculture
Рубрика: Актуальные вопросы зоотехнии и ветеринарии
Статья в выпуске: 2 (51), 2026 года.
Бесплатный доступ
Кормовые препараты, содержащие лизин производят методом глубинной ферментации с применением микроорганизмов рода Bacillus. Данные микроорганизмы обладают высокой ферментативной активностью и культивируются на питательных средах, содержащих моносахариды. Конечным продуктом ферментации является лизин. L-лизин это одна из важнейших незаменимых аминокислот, входящих в состав кормов, для животных. Перспективным направлением на сегодняшний день является получение кормовых концентратов, содержащих лизин, которые незаменимы для роста, продуктивности и здоровья скота и птицы. Проведено исследование по получению лизинсодержащего концентрата кормового назначения с использованием бактерии Bacillus subtilis, которая способна аккумулировать лизин в форме субтилина, включающего 32 аминокислоты. Бактерии Bacillus subtilis обладают высокой скоростью роста и хорошо изученной способностью к секреции белка. Они характеризуются ферментативными свойствами и отсутствием токсичных побочных продуктов, что делает их незаменимыми для промышленного использования. Для получения лизинсодержащего препарата был использован штамм Bacillus subtilis B-4828. Для оптимизации условий получения лизинсодержащего концентрата использовался метод Бокса-Уилсона, который включал полный факторный эксперимент с варьированием факторов по определению состава питательной среды. Установлено, что для приготовления оригинальной питательной среды необходимо смешать фильтрат культуральной жидкости Corynebacterium glutamicum B-1085 после ферментации, которая содержит в среднем 11,9 г/л лизина, с концентратом ферментолизата злаковых культур до уровня редуцирующих веществ 50 г/л, а также добавить пептон в количестве 9,11 г/л. Готовый лизинсодержащий концентрат получают путем инактивации биомассы B. subtilis B-4828 с использованием температурного фактора. Затем к нему добавляют непрогидролизованный отход ферментативного гидролиза, тщательно перемешивают и гранулируют. Максимальная концентрация лизина в таком концентрате составляет 104,47 мг/г.
L-лизин, bacillus subtilis, лизинсодержащий концентрат, субтилин, полный факторный эксперимент, питательная среда
Короткий адрес: https://sciup.org/147254643
IDR: 147254643 | УДК: 663.18:579.62
Optimization of conditions for producing a lysine-containing fodder product based on enriched lysine
Feed preparations containing lysine are produced by deep fermentation using microorganisms of the genus Bacillus. These microorganisms have high enzymatic activity and are cultivated on nutrient media containing monosaccharides. The end product of fermentation is lysine. L-lysine is one of the most important essential amino acids found in animal feed. A promising direction today is the production of feed concentrates containing lysine, which are indispensable for the growth, productivity and health of livestock and poultry. A study was conducted on the production of lysine-containing concentrate for feed purposes using the bacterium Bacillus subtilis, which is capable of accumulating lysine in the form of a subtilin, including 32 amino acids. The bacteria Bacillus subtilis have a high growth rate and a well-studied ability to secrete protein. They are characterized by enzymatic properties and the absence of toxic by-products, which makes them indispensable for industrial use. The strain Bacillus subtilis B-4828 was used to obtain the lysine-containing drug. To optimize the conditions for obtaining lysine-containing concentrate, the method was used Box-Wilson, which included a complete factor experiment with varying factors to determine the composition of the nutrient medium. It was found that to prepare the original nutrient medium, it is necessary to mix the filtrate of the culture liquid Corynebacterium glutamicum B-1085 after fermentation, which contains an average of 11.9 g/l of lysine, with the concentrate of fermentolysate of cereals to the level of reducing substances 50 g /l, and also add peptone in the amount of 9.11 g/l. The finished lysine-containing concentrate is obtained by inactivation of biomass Bacillus subtilis B-4828 using the temperature factor. Then the non-hydrolyzed waste of enzymatic hydrolysis is added to it, thoroughly mixed and granulated. The maximum concentration of lysine in this concentrate is 104.47 mg/g.
Текст научной статьи Оптимизация условий получения лизинсодержащего концентрата кормового назначения на обогащенной лизином основе
Введение. В современной практике производства кормовых препаратов, содержащих лизин, применяется метод глубинной ферментации. Для ферментационных процессов применяются микроорганизмы, принадлежащие к родам Corynebacterium , Brevibacterium и Bacillus . Эти микроорганизмы демонстрируют высокую ферментативную активность, что делает их перспективными для использования в различных биотехнологических приложениях. Культивирование данных бактерий происходит в питательных средах, основанных на моносахарах. После завершения ферментативного процесса лизин проходит через серию этапов очистки и сушки. Конечным продуктом является, например, L-лизина сульфат, широко используемый в качестве кормовой добавки [10].
Производство аминокислот представляет собой одно из наиболее актуальных направлений современной биотехнологии. Эта сфера является значимой, поскольку незаменимые аминокислоты необходимы для нормального роста и развития организма, который не способен синтезировать их самостоятельно. В связи с этим они классифицируются как незаменимые и должны регулярно поступать в организм с пищей. При отсутствии даже одной из незаменимых аминокислот организм не может производить достаточно белка для сохранения своих тканей [9].
Аминокислоты играют ключевую роль в улучшении качества белков растительного происхождения в кормах для животных. Их добавление позволяет повысить питательную ценность белков до уровня, сопоставимого с высококачественными белками животного происхождения. Это изменение аминокислотного состава рационов не только существенно снижает затраты на корма (экономия составляет 2025%), но и значительно повышает продуктивность животноводства [2].
Влияние незаменимых аминокислот, включая L-лизин, обусловлено тем, что белки зерновых, являющиеся основой кормов для сельскохозяйственных животных и птиц, имеют неблагоприятный аминокислотный состав. В частности, L-лизин находится в дефиците и не синтезируется в организме животных. Для устранения этого дефицита в рацион добавляются белковые добавки, богатые L-лизином, такие как рыбная и мясокостная мука, соевый и подсолнечни-ковый шрот, а также гидролизные и кормовые дрожжи. Также дефицит можно компенсировать путём введения в корм кристаллического L-лизина [9].
Кормовой концентрат лизина, являющийся перспективным препаратом микробиологического происхождения, представляет собой важный элемент в экономической и биологической сферах. Этот препарат, помимо основного действующего вещества, включает в себя целый комплекс биологически активных соединений. Исследования показали, что концентратная форма лизина благодаря этим дополнительным компонентам демонстрирует более высокую эффективность по сравнению с кристаллической формой [7].
Применение кормовой смеси, обогащённой лизином, обеспечивает её безопасность для животных. Лизин способствует укреплению иммунной системы у крупного рогатого скота и птицы, а также стимулиру- ет синтез ферментов и гормонов [8]. Препарат оптимизирует метаболизм азота и углеводов, что особенно заметно при активном росте молодняка. Лизин оказывает положительное воздействие на состояние перьевого покрова у птиц.
Таким образом, исходя из вышесказанного, целью данной работы являлось получение лизинсодержащего концентрата кормового назначения при использовании Bacillus subtilis , который способен аккумулировать в своей биомассе лизин в форме субтили-на, содержащего 32 аминокислоты. Бактерии Bacillus subtilis, характеризуются высокой скоростью роста, у них хорошо изучена способность к секреции белка, они отличаются ферментативными свойствами и отсутствием токсичных побочных продуктов, что делает их незаменимыми для промышленного применения. Ряд штаммов Bacillus subtilis используют для получения фармацевтических препаратов и пищевых добавок.
Объекты и методы исследования.
Исследования проводились в научноисследовательской лаборатории кафедры Биотехнологии и химии имени профессора Н.Е. Павловской, в ЦКП «Орловский региональный центр сельскохозяйственной биотехнологии» ФГБОУ ВО Орловский ГАУ, в лаборатории аналитических и регистрационных испытаний ФИЦ «Немчиновка».
Для получения лизинсодержащего препарата был использован штамм Bacillus subtilis B-4828. Данный штамм проявил наибольшую способность к аккумуляции лизина в своей биомассе при культивировании на оригинальной питательной среде, что составило 66±3,3 мг/г [4,5].
Питательную среду для B. subtilis B-4828 готовили на обогащенной лизином основе из культуральной жидкости от культивирования Corynebacterium glutamicum B-1085, содержащей в среднем 11,9 г/л лизина [3]. Культуральную жидкость отделяли от биомассы C. glutamicum B-1085 сепарированием и определяли концентрацию редуцирующих веществ [1] и общего азота [6].
На основании полученных результатов, концентрации компонентов доводили до значений, согласно матрицы, планирования эксперимента по плану N =2 k , где факторы варьирования: пептон, г/л ( X 1 ); редуцирующие вещества, г/л ( X 2 ); параметр оптимизации y – концентрация лизина в биомассе, мг/г. Состав питательной среды оптимизировали методом Бокса-Уилсона. В таблице 1 представлено распределение уровней факторов в ходе эксперимента.
Таблица 1. - Распределение уровней факторов эксперимента
|
Уровень |
Фактор |
|
|
X 1 |
X 2 |
|
|
x i ° |
15 |
27 |
|
Δ x i |
5 |
7,5 |
|
min x i |
10 |
19,5 |
|
max x i |
15 |
34,5 |
Инокулят B. subtilis B-4828 готовили из суточной агаровой культуры, которую пересевали в колбы Эр- ленмейера с жидкой питательной средой «L» без углеводов, и инкубировали на шутль-аппарате при 28°С. На поздней логарифмической стадии роста бактериальную суспензию инокулировали в объеме 0,5% (v/v) объёма питательной среды для культивирования B. subtilis B-4828. В ходе культивирования в биореакторе Minifors (Infors, Швейцария) контролировали и поддерживали на заданном уровне температуру +28±0,5°С, рН 7,0±0,2 и рО2 ≥20±0,5%, частота вращений мешалки 200 мин-1. Корректировка текущих параметров производилась программным обеспечением IRIS 2.0 автоматически.
Определение содержания лизина в биомассе осуществлялось в соответствии с ГОСТ 13496.21-2015 «Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения лизина и триптофана».
Рис.1 - Прирост биомассы B. subtilis B-4828
и концентрация лизина в постановках ПФЭ
Данное обстоятельство указывает на то, что при культивировании B. subtilis B-4828 на оригинальной питательной сахаросодержащей среде целесообразно ограничить культивирование продуцента истощением субстрата, т.е. через 36 часов от инокуляции необходимо завершить процесс накопления лизина.
Результаты определения концентрации лизина в биомассе продуцента воспроизводимы, так как критерий Кохрена: р G = 0,44 меньше т G 0,95;4;9 = 0,5. Рассчитаны коэффициенты регрессионного уравнения, отличие от нуля которых проверяли по критерию Стьюдента: t 0,95;32 = 2,04. При подстановке числовых выра-
Экспериментальные исследования проводились в трехкратной повторности и включали три серии. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2003. Данные в таблицах представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.
Результаты исследований и их обсуждение.
При реализации полного факторного эксперимента по определению состава питательной среды для глубинного культивирования B. subtilis B-4828 была установлена прямая зависимость концентрации лизина и биомассы продуцента при r = 0,94 (см. рис. 1).
жений значимых коэффициентов математическая модель приобрела вид:
y = 65,03 – 0,49 Х 1 + 0,87 Х 2 – 0,87 Х 1 Х 2 .
Модель адекватно описывает изучаемый процесс и может быть использована в процедуре оптимизации условий получения лизинсодержащего концентрата, что подтверждается значением критерия Фишера: р F = 0,53 меньше т F 0,95;2;32 = 3,29. Параметры оптимизации представлены в таблице 2.
На четвёртом раунде получены результаты, позволяющие остановить процедуру (см. рис. 3).
Таблица 2 - Оптимизация состава питательной среды для получения лизинсодержащего концентрата
|
Параметры |
факторы |
||
|
X 1 |
X 2 |
||
|
Расчётный интервал, λ i |
-2,45 |
6,525 |
|
|
Расчётный интервал округлённый, °λ i |
2,5 |
6,5 |
|
|
Пропорциональность, θ |
0,38 |
1 |
|
|
Шаг по градиенту, δ x i |
-1,96 |
7,47 |
|
|
Эксперимент |
оптимизация №1 |
13,04 |
34,47 |
|
оптимизация №2 |
11,08 |
41,94 |
|
|
оптимизация №3 |
9,11 |
49,41 |
|
|
оптимизация №4 |
7,15 |
56,89 |
|
Оптимизация признаётся эффективной, так как при реализации активного эксперимента было достигнуто максимальное значение концентрации лизина в биомассе B. subtilis B-4828 и составило 104,47 мг/г, которое превысило спрогнозированное значение на 3,78%. Концентрация лизина в культуральной жидкости вышла за предел количественного определения, что свидетельствует о полноте его извлечения.
Завершив культивирование бактериальную суспензию – лизинсодержащий концентрат инактивируют нагреванием до 45-50 °С и направляют в производство готового продукта – гранул кормового назначения.
Выводы. В данной работе были оптимизированы условия получения лизинсодержащего концентрата кормового назначения на обогащенной лизином основе. Для приготовления оригинальной питательной среды необходимо соединить фильтрат культуральной жидкости Corynebacterium glutamicum B-1085, содержащий в среднем 11,9 г/л лизина; концентрат ферментолизата злаковых культур до концентрации редуцирующих веществ 50 г/л; пептон – 9,11 г/л. Готовую форму лизинсодержащего концентрата получают путем инактивации биомассы B. subtilis B-4828 температурным фактором, к нему необходимо добавить непрогидролизованный отход от фермента- тивного гидролиза, перемешать и гранулировать. Максимальное значение концентрации лизина в концентрате, содержащем лизин, составляет 104,47 мг/г.
Заключение
Незаменимые аминокислоты должны присутствовать в рационе животных и птиц с первых дней жизни. Сбалансированное кормление – основа качества сельскохозяйственной продукции. Применение аминокислотных рационов в питании сельскохозяйственных животных и птицы позволит увеличить питательную ценность рациона с минимальными финансовыми и временными затратами.
Лизинсодержащие концентраты в питании животных представляют собой кормовые добавки, которые незаменимы для роста, продуктивности и здоровья скота и птицы. Они улучшают привесы, удои молока, яйценоскость, а также укрепляют иммунитет, способствуют синтезу мышечной ткани, гормонов и антител. Эти концентраты используются для балансирования рационов, особенно когда содержание лизина в натуральных кормах недостаточно. Позволяют более точно регулировать содержание аминокислот в рационе, что особенно важно для молодняка.
