Опыт применения дермального эквивалента в комплексном лечении синдрома диабетической стопы

В настоящее время многие исследователи рассматривают сахарный диабет (СД) как неинфекционную пандемию, охватившую планету: только по обращаемости насчитывается 366 млн. больных СД (7% всего населения планеты), более 50% из них – лица трудоспособного возраста. [7].

Синдром диабетической стопы (СДС) – одно из наиболее частых и опасных осложнений СД, характеризуется возникновением хронических гнойно-некротических процессов (трофических язв) на стопе с поражением кожи, мягких тканей и костно-суставного аппарата, вследствие патологических изменений в периферической нервной системе (диабетическая нейропатия) и в сосудистой системе (диабетическая ангиопатия) [15]. Возникновение СДС отмечается у 20–80% больных СД в возрасте от 20 до 75 лет, у большинства из них возникает угроза малой или высокой ампутации нижней конечности [1, 2, 11, 17, 19]. В год в мире по поводу СДС производится до 200 тыс. высоких ампутаций [3].

Патофизиология СДС, обусловлена комбинацией таких процессов, как нейропатия, нарушение регионарной гемодинамики и иммунитета, инфекция и травма, что в совокупности создает порочный круг. Стандарт медицинской помощи для лечения пациентов с СДС предусматривает мультидисциплинарный подход, который включает коррекцию углеводного обмена, обеспечение адекватной перфузии конечностей, дебридмент нежизнеспособных тканей, разгрузку стопы от избыточного давления, подавление и контроль инфекции, местное лечение язв и обучение пациента правилам жизни и ухода за нижними конечностями. К со-

жалению, не смотря на достижения медицины, лечение трофических диабетических язв остается сложной проблемой: сроки заживления, как правило, очень длительные: даже с лучшим доступным стандартом терапии в течение 12 - 20 недель, могут зажить соответственно только 24% - 30% диабетических язв [15]; нередко такие язвы вообще плохо поддаются стандартному лечению; также при СДС очень высок риск рецидива уже заживших язв [22].

Одним из методов закрытия раневых дефектов является аутодермопластика свободным расщепленным лоскутом. Однако, по данным литературы, аутодермопластика для закрытия язвенных дефектов при СДС является недостаточным эффективным методом лечения [5, 6, 14]. Результат закрытия раневого дефекта не всегда успешен и технически труден на определенных отделах стопы. Риск отторжения трансплантата при этом, по данным различных авторов составляет 10–30%. Кроме того, на фоне диабетической полинейропатии, микро- и макроангиопатии высок риск образования дополнительного хронического раневого дефекта в области взятия кожного лоскута. Так, по данным различных авторов, эпителизация донорских участков осложняется нагноением и длительным заживлением в 5-70% случаев [8, 14]. При этом длительное заживление донорских ран ведёт к образованию гипертрофических и келоидных рубцов [8]. Серьезной причиной неудач трансплантации аутологичной кожи является отсутствие объективных методов адекватной оценки готовности раны к аутодермопластике, которая в настоящее время осуществляется лишь на основании клинической оценки состояния больного и визуальных признаков гранулирующей раны. В связи с перечисленными выше обстоятельствами, необходим поиск новых методов лечения, направленных на ускорение заживления раневого дефекта при СДС.

Исследования последних лет в области биохимии, патофизиологии, иммунологии открыли некоторые, ранее неизвестные, молекулярно-клеточные механизмы, объясняющие причину хронизации раневого процесса, что позволило по-новому подойти к решению проблемы лечения хронических ран (трофических язв). В качестве одного из таких перспективных направлений лечения хронических ран (трофических язв) является применение клеточных технологий: ауто- и аллогенных культур клеток кожи, живого кожного эквивалента [9]. В зарубежных исследованиях показана высокая клиническая эффективность применения биоинженерных заменителей кожи, таких как «Dermagraft» (Advanced Tissue Sciences, США), «AlloDerm» (LifeCell, США), «Apligraf» (Organogenesis, США) для лечения хронических, в том числе диабетических трофических язв [16, 18, 20, 21, 23]. В России применение аналогичного отечественного биоинженерного продукта «Эквивалента Дермального» (ЭД) (производства НИИ цитологии РАН) - аллогенных фибробластов, заключенных в коллагеновый гель, оказалось эффективным при лечении обширных ожогов и трофических язв венозной этиологии [4, 12, 13]. Однако, систематизированных сведений по применению ЭД в лечении трофических язв при СДС в научной литературе нам не встретилось.

Цель исследования: оценить эффективность, безопасность, и факторы, влияющие на применение ЭД для заживления ран при СДС, длительность терапевтического эффекта и отдаленные результаты.

Материал и методы

В исследование были включены 60 пациентов, из числа больных с СДС, проходивших лечение в 2013–2016 годах в отделениях гнойной хирургии Госпиталя для ветеранов войн и Городской больницы №14 г. Санкт-Петербурга. Среди пациентов было 26 мужчин, 34 женщины. Возраст обследуемых пациентов: от 46 до 90 лет (средний возраст 68±22 лет). Критерии включения: пациенты обоего пола старше 18 лет, у которых по данным клинического и инструментального обследования имеется СДС с язвенным дефектом стоп в стадии грануляции, площадью от 1 до 25 см2, который существует более 6 недель, не распространяется на кости, мышцы, сухожилия (класс 1А, 1С по Техасской классификации [15]), если площадь язва не уменьшалась в размерах на 50% и более после 2-х недель стандартной терапии. Пациенты давали добровольное информированное письменное согласие на участие в исследовании.

В зависимости от использованного метода лечения все больные были разделены на две сопоставимые по возрастному и половому составу группы — основную и контрольную, отобранные методом случайной выборки. В основной группе пациентам дополнительно к стандартному лечению применяли аппликацию на трофическую язву ЭД, а в контрольной группе - проводили только стандартное лечение. Таким образом основная группа (40 пациентов) состояла из подгруппы А - 20 пациентов с нейропатической формой СДС и подгруппы Б - 20 пациентов нейроишемической формой СДС; а контрольная группа (20 пациентов) состояла из подгруппы А1 - 10 пациентов с нейропатической формой СДС и подгруппы Б1 - 10 пациентов с нейроишемической формой СДС (табл. 1).

Стандартное комплексное лечение СДС включало в себя: коррекцию углеводного обмена с участием врача эндокринолога, дебридмент гнойного очага с использованием ультразвуковой кавитация («Sonoca 400», Söring, Германия) и вакуумтерапии (VivanoTec, Hartmann, Германия) с последующими ежедневными перевязками с антисептиками и местными антибактериальными средствами (левомеколь, бетадин) и стандартными перевязочными средствами (марлевые повязки), системную антибиотикотерапию, ангио- и нейротропную терапию, включая внутривенные инфузии Вазапростана; дополнительные методы лечения - гиперба-

Таблица 1

Распределение обследуемых пациентов по группам/подгруппам, характеру лечения

Группы, количество пациентов	Подгруппы, количество пациентов	Характер лечения
Основная (n=40)	А – нейропатичесая форма СДС (n=20) Б – нейроишемическая форма СДС (n=20)	Стандартное комплексное лечение + аппликация на рану ЭД
Контрольная (n=20)	А1 – нейропатичесая форма СДС (n=10) Б1 – нейроишемическая форма СДС (n=10)	Стандартное комплексное лечение

Обозначение: n – количество пациентов

рическую оксигенацию, фотомодификацию крови (внутривенное лазерное облучение крови), озонотерапию. Кроме того, при нейроишемической форме у больных основной и контрольной групп, по возможности, дополнительно проводилась эндоваскулярная реваскуляризация конечности (чрезкожная баллонная ангиопластика, стентирование). Также применяли разгрузку пораженной стопы от давления: использовали костыли и кресло-коляску. После очищения язв и появления грануляций производился бактериологический контроль отделяемого из язвы с количественным подсчетом микробной обсемененности [10, 11].

Пересадка на рану ЭД пациентам основной группы проводилась в условиях перевязочной. ЭД получали в день пересадки из НИИ цитологии РАН (Санкт-Петербург, РФ), его транспортировка осуществлялась в герметичных чашках Петри, в сосуде Дьюара, с поддерживанием температуры +15°C, в максимально щадящем для клеточных культур режиме, исключающем механическое и термическое воздействие, среднее время доставки составило 120±35 мин. ЭД извлекали пинцетом из чашки Петри, укладывали на обработанную физиологическим раствором хлорида натрия раневую поверхность, полностью покрывая ее площадь (pис 1–3). Сверху накладывали повязку Воскопран (Био-текфарм, РФ), для предотвращения впитывания препарата, наложенной затем марлевой повязкой и фиксировали марлевым бинтом. Перевязки проводились через день. Производилось орошение марлевой повязки физиологическим раствором хлорида натрия 2 раза в день, для предотвраще-

Рис. 2. Микрофотография дермального эквивалента (инвертированный микроскоп, увеличение объектива х10)

Рис. 1. Дермальный эквивалент перед применением

Рис. 3. Аппликация дермального эквивалента на диабетическую трофическую язву

Рис. 4. Полная эпителизация язвы через 2 месяца после применения дермального эквивалента ния высыхания повязки в соответствие с инструкцией по применению ЭД [4]. После выписки больных из стационара на амбулаторное лечение, для оценки длительности эффекта от применения ЭД проводили наблюдение и мониторинг за ними в течение 18 месяцев.

В обеих группах у пациентов определяли скорость заживления раневого дефекта. Для этого использовали параллельно две методики:

• 1.    Метод контактной планиметрии: накладывали на язвенный дефект прозрачную стерильную полиэтиленовую пленку, обводили на ней контур язвы до начала лечения, через 30 и 60 суток после лечения; вручную подсчитывали площадь язвы; скорость эпителизации рассчитывалась по формуле:

• 2.    Метод цифровой фотосъемки трофической язвы с последующим аналогичным компьютерным расчетом площадей дефекта и скорости эпителизации. Для оценки безопасности применения ЭД – после его аппликации у пациента оценивали жалобы: аллергические проявления, местные воспалительные изменения краев раны, исследовали клинический и биохимический анализ крови, анализ мочи.

Vs = (S-Sn)/t.

где S - площадь язвы до лечения, Sn - площадь при последующих измерениях, t - число дней между измерениями;

Для оценки факторов и условий, оказывающих неблагоприятное влияние для приживления ЭД изучали:

• 1.    уровень бактериальной обсемененности язвы по данным бактериологических посевов;

  
  

• 2.    состояние регионарной гемодинамики по данным ультразвукового дуплексного сканирование артерий нижних конечностей с определение лодыжечно-плечевого индекса (ЛПИ)

• 3.    кислородное обеспечение тканей пораженной стопы по данным транскутанного напряжение кислорода (ТсРО2) на стопе (Radiometer, Дания);

• 4    анализировали сопутствующие заболевания. Для оценки длительности эффекта от применения ЭД проводили наблюдение и мониторинг за пациентами в течении 18 месяцев после лечения.

Полученные результаты подвергались статистической обработке с сопоставлением средних показателей (M±m) скорости эпителизации в обследуемых группах/подгруппах. Достоверность различий определяли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Достоверными принимали значения p<0,05.

Финансирование работы по культивированию «Эквивалента Дермального» в ФГБУН «Институт Цитологии РАН» осуществлялось при поддержке гранта РНФ № 14-50-00068 «Молекулярно-клеточные технологии для лечения социально значимых заболеваний».

Результаты

В основной группе у 29 (72,5%) больных (из них 17 пациентов подгруппы А, 12 пациентов подгруппы Б) уже на 2-ые сутки после трансплантации ЭД над всей поверхностью язвенного дефекта образовывалась тонкая пленка. В дальнейшем под этой пленкой шла активная краевая эпители-зация, визуально отмеченная со 2-х суток после пересадки ЭД. В течение первой недели новообразованный эпителий отличались низкой устойчивостью к травматизации, что требовало бережного и атравматичного выполнения перевязок (рис. 3).

Средняя скорость эпителизации ран в основной группе в течение первого месяца после начала использования ЭД была достоверно (p<0,05) выше, по сравнению с контрольной для обеих сопоставляемых подгрупп. В течение второго месяца после применения ЭД, средняя эпителизации снизилась и показатели, хотя и были несколько выше, чем в подгруппах контрольной группы, но достоверного отличия не выявлено. При сравнении средней скорости эпителиза-ции между подгруппами основной группы, применение ЭД оказалось более эффективным при нейропатической форме СДС (табл. 2). Показатели ТсРО2 различались в подгруппах с нейропатической и нейроишемической формами СДС и указывали на лучшую оксигенацию тканей при нейропатической форме СДС: показатель в подгруппе А составил 45-56 (49±5) мм рт.ст., в подгруппе А1: 46-55 (49±5) мм рт.ст.; в подгруппе Б - 30- 46 (41±5) мм рт.ст; в подгруппе Б1: 30-47 (42±4) мм рт.ст. Показатели ЛПИ также отличались: в подгруппе А - 0,80-1,07 (0,88±18); в подгруппе А1 - 0,83-1,06 (0,90±9), в подгруппе Б - 0,38-0,76 (0,57±12), в подгруппе Б1 - 0,40-0,75 (0,58±13).

Из 40 пациентов основной группы у 33 пациентов (82,5%) (18 пациентов подгруппы А и 15 пациентов подгруппы Б) скорость эпителизации достоверно превысила скорость эпителизации в контрольной группе (по сравнению с показателями соответствующей подгруппы), т.е. применение ЭД было эффективным, по сравнению со стандартным лечением. У 7 пациентов основной группы (17,5%) из них у 2 пациентов подгруппы А и у 5 пациентов подгруппы Б, скорость эпителизации не превысила показатели контрольной группы, т.е. применение ЭД не оказалось эффективным. Анализ пациентов основной группы, где применение ЭД не дало эффекта, показал, что у 4 пациентов (подгруппа Б) были проявления критической ишемии: низкие показатели ТсРO2 менее 35 мм рт.ст., ЛПИ менее 0,45 у них име-

Таблица 2

Средняя скорость эпителизации трофических язв в обследованных группах/подгруппах больных в период первого и второго месяца после начала лечения

Группы исследования/подгруппы	Средняя скорость эпителизации за период первых 30 суток (cм2 в сутки)	Средняя скорость эпителизации за период вторых 30 суток (cм2 в сутки)
Основная/ подгруппа А (больные с нейропатической формой СДС)	0,42±0,06*	0,24±0,06
Основная/ подгруппа Б (больные с нейроишемической формой СДС)	0,11±0,05*	0,09±0,05
Контрольная/ подгруппа А1 (больные с нейропатической формой СДС)	0,25±0,09	0,18±0,09
Контрольная/ подгруппа Б1 (больные с нейроишемической формой СДС)	0,06±0,08	0,05±0,08

Обозначение: * – достоверное (p<0,05) различие между показателями сравниваемых подгрупп в основной и контрольной группах.

лась высокая окклюзия (поверхностной бедренной, общей бедренной, подвздошных артерий). Результаты исследования показали, что во всех случаях эффективного применения ЭД исходный показатель ТсРО2 у пациентов был более 35 мм рт.ст., а ЛПИ более 0,45. У 3 пациентов (2 из подгруппы А, 1 из подгруппы Б) после применения ЭД размеры язвы оказались прежними, на третьей перевязке появились налеты фибрина в дне и усилилось серозное отделяемое из язвы, что, видимо, было обусловлено высокой степенью бактериальной обсемененности язвы (>105 на 1 см3) до аппликации ЭД, тогда как во всех случаях эффективного применения ЭД микробная обсемененность раны была ниже 105 на 1 см3. Также выявлено негативное влияние на эффективность применения ЭД следующей сопутствующей патологии у пациентов: наличие хронического отека нижней конечности или вследствие хронической венозной недостаточности на почве варикозной болезни или постромботической болезни нижних конечностей; или из-за хронической сердечной недостаточности в стадии декомпенсации.

В основной группе самая высокая скорость эпителиза-ции была у тех пациентов, у которых была низкая бактериальная обсемененность, достаточный ЛПИ и напряжение кислорода, отсутствовали сопутствующие заболевания вен и хронический отек нижних конечностей.

Во всех случаях применение ЭД не зарегистрировано каких-либо побочных отрицательных явлений; развития местных и общих аллергических реакций, изменений со стороны стандартных анализов крови и мочи.

При наблюдении за больными в сроки до 18 месяцев было отмечено следующее.

В основной группе после первичного применения ЭД удалось полностью заживить ра-невой дефект у 26 пациентов (65%) - 16 пациентов подгруппы А и 10 пациентов подгруппы Б сроки заживления составили от 1 до 3-х месяцев (в среднем 67±11 суток). Как правило, это были пациенты с небольшой площадью раневого дефекта от 2 до 12 см2 (в среднем 7±5 см2). Отмечено, что первый месяц идет активная эпителизация, и язвенный дефект сокращается на 70%, затем, хотя скорость эпителизации существенно уменьшается, но тем не менее язвенный дефект эпителизирует в сроки до 3-х месяцев. Клини-ческий пример применения ЭД представлен на рисунках 3 и 4.

У 7 пациентов основной группы (17,5%) (2 пациента подгруппы А, 5 пациента под-группы Б) в связи со снижением скорости и большими по площади язвенные дефекты от 12 до 25 см2 (в среднем 18±6 см2) в сроки от 3-х до 4-х месяцев была повторно вы-полнена аппликация ЭД (после оценки уровня микробной обсемененности раны и кровоснабжения тканей и признания их удовлетворяющими критериям применения ЭД), при этом удалось добиться полного заживления раневого дефекта у 4-х пациентов (2 пациента подгруппы А, 2 пациент подгруппы Б). У 3-х пациентов (все подгруппы Б) основной группы, даже после повторного применения ЭД, полностью заживить раневой дефект так и не удалось, хотя его размеры значительно уменьшились.

Таким образом, в указанные сроки наблюдения (18 месяцев) у 10 пациентов основной группы (2 пациента подгруппа А, 8 пациентов подгруппы Б) так и не удалось добиться полной эпителизации язвы. У 7 из них (2 пациента подгруппы А, 5 пациентов подгруппы Б) применение ЭД не оказалось эффективным, скорость эпителизации не увеличилась. У 3-х пациентов размеры язвы после повторного применения ЭД уменьшились, однако, язвенный дефект до конца не эпи-телизировал. В контрольной группе результаты в эти сроки наблюдения были следующие. Полное заживление удалось достичь у 8 пациентов (40%) (5 пациентов подгруппы А1, 3 пациента подгруппы Б1), но сроки были значительно дольше, чем в основной группе: 4-10 месяцев (в среднем 145±36 суток). Полное заживление не достигнуто у 12 пациентов (5 из подгруппы А1, 7 из подгруппы Б1). Среди 3-х пациентов основной группы с полностью зажившей трофической раной через сроки от 2 до 4 месяцев возник рецидив язвы (2 пациента из подгруппы А, 1 пациент из подгруппы Б). У больных контрольной группы рецидива язвы отмечен у 6 пациентов в сроки от 2 до 4 месяцев (4 пациентов из подгруппы А1, 2 пациента из подгруппы Б1).

Обсуждение

Полученные нами результаты, согласуются с имеющимися в литературе данными по применению зарубежных аналогов ЭД [16, 18, 21, 23]. Эффективность применения ЭД при диабетических трофических язвах оказалась ниже, чем при трофических язвах венозной этиологии [4, 12, 13], что может объясняться значительно более существенными нарушениями микроциркуляции и доставки кислорода к тканям при СДС. ЭД - это аллогенные дермальные фибробласты, заключенные в коллагеновый гель. Дермальные фибробласты представляют собой гетерогенную популяцию клеток мезенхимального ряда и играют ключевую роль в процессах регуляции клеточных взаимодействий и поддержания гомеостаза кожи. Фибробласты не только формируют оптимальные условия для функционирования и пролиферации других типов клеток (эпителиальных, эндотелиальных, клеток волосяных фолликулов), но и отвечают за координацию их функций в соответствии с расположением на теле. Способность фибробластов формировать межклеточный матрикс, синтезировать цитокины, вызывать миграцию и пролиферацию различных типов клеток при повреждении кожи делает их перспективным для широкого клинического применения [8]. Эффект от применения ЭД на стимуляцию эпителизации большинство исследователей связывают с действием цитокинов и факторов роста, выделяющихся из функционирующих трансплантированных дермальных фибробластов, но, поскольку, они являются аллогенными, то вскоре гибнут, и этим, по-видимому, объясняется, факт существенного снижения скорости эпителизации спустя месяц после начала применения ЭД. Отмеченные в исследовании более высокие показатели скорости эпителизации при нейропатической форме СДС, по сравнению с ней-роишемической формой объясняются, лучшими исходными показателями кровоснабжения тканей (более высоким уровнем ТсРO2). Выявленные факторы: низкий уровень ТсРO2, низкий ЛПИ (недостаточная реваскуляризация конечностей), хронический отек нижних конечностей, бактериальная обсемененность (>105 на 1см3) препятствуют функционированию ЭД в ране и делают его применение неэффективным. Эффективность повторного применения ЭД при трофических язвах другой этиологии отмечали ранее и другие исследователи [8]. Рецидив развития трофических язв, наблюдаемый у части больных основной группы все же возникал реже и позже, чем у пациентов контрольной группы, что может указывать на более прочную структуру рубца после применения ЭД.

Выводы

• 1.    Применение ЭД у больных с СДС в стадию грануляции стимулирует процессы заживления и ускоряет скорость эпителизации по сравнению со стандартным лечением, в большей степени при нейропатической форме.

• 2.    Применение дермального эквивалента у больных СДС безопасно.

• 3.    Увеличение скорости эпителизации ран после применения ЭД у больных СДС наиболее выражено в первый месяц после применения, затем она снижается, т.е. терапевтический эффект длится около месяца, повторное применение ЭД вновь ускоряет эпителизацию.

• 4.    Факторы ограничивающие применения дермального эквивалента у больных с СДС низкие показатели TcPО₂ -менее 35 мм рт.ст., ЛПИ<0,45 (вероятность высокой окклюзии артерий нижних конечностей); высокая степень бактериальной обсемененности > 10⁵ на 1см³, хронический отек нижних конечностей.

• 5.    Применение ЭД у больных СДС в сроки наблюдения до 18 месяцев дает лучше результаты по сравнению со стандартным лечением.