Особенности активности ферментов в дуоденальном химусе и крови цыплят-бройлеров и их влияние на метаболизм в условиях теплового стресса при ЭМИ-обработке

Введение. Среди мясных отраслей, несомненно, наиболее успешной является птицеводческая промышленность. Стандарты производства бройлеров постоянно улучшались за последние несколько десятков лет, и в настоящее время бройлеры-самцы способны достигать живого веса 2,6 кг в возрасте 33-35 дней. Генетический отбор, осуществляемый коммерческими племенными компаниями, отвечает за большую часть улучшений в росте бройлеров [1,2]. Необходимость достижения и поддержания улучшений генетического потенциала является движущей силой последних достижений в области питания птицы, и одновременно с этим происходиn усовершенствование питания и кормления коммерческой птицы, начиная с вывода.

На пищеварительную функцию бройлеров влияет множество факторов, в том числе условия содержания. Плохая вентиляция может привести к накоплению аммиака и других вредных газов, что может вызвать раздражение дыхательных путей и ухудшение общего состояния птиц [3]. Освещение также влияет на поведение и аппетит птиц; исследования показывают, что использование различных режимов освещения может улучшить рост и развитие бройлеров [4]. Высокая плотность посадки может привести к повышенному уровню стресса и агрессии среди птиц, что может негативно сказываться на их аппетите и общем состоянии здоровья [5]. Температура окружающей среды является еще одним критически важным фактором, влияющим на пищеварение и метаболизм бройлеров. Высокие температуры могут вызвать тепловой стресс, который, как известно, негативно сказывается на аппетите и метаболизме [6].

Стрессовые условия могут вызывать изменения в гормональном фоне и снижать аппетит, что приводит к недостаточному поступлению питательных веществ [7]. Эти факторы подчеркивают необходимость создания оптимальных условий для содержания бройлеров, чтобы минимизировать стресс и поддерживать их здоровье.

Современные генотипы птиц обладают высоким потенциалом продуктивности, однако зачастую этот потенциал реализуется не полностью из-за воздействия стрессовых факторов [8]. Стресс считается одним из ведущих негативных факторов, ухудшающих метаболизм и процессы переваривания, особенно при условии содержания, транспортировки и социальных взаимодействий, которые могут возникать вследствие изменений окружающей среды и условий содержания.

Установлено, что пищеварительные ферменты (амилаза, липаза, трипсин) всасываются в кровь и постоянно циркулируют в кровяном русле, однако физиологическая роль панкреатических ферментов в крови полностью не изучена и существует противоречивое мнение об энтеропанкреатической циркуляции пищеварительных ферментов. Очевидно, что повышение конверсии корма в животноводческую продукцию невозможно без эффективной работы пищеварительных желез, способности их адаптироваться к изменяющимся условиям питания. Факт наличия панкреатических ферментов в крови подтверждает точку зрения о том, что они могут всасываться в кровоток, поступать с кровью в поджелудочную железу и секретироваться в кишечник повторно, не распадаясь в кишечнике до аминокислот. Высокая температура негативно влияет на продуктивность, вызывая изменения обменных процессов, дисбаланс кислотно-щелочного и электролитного балансов, а также снижая активность пищеварительных ферментов, таких как трипсин, химотрипсин и амилаза, а также уровни витаминов и минералов [9,10].

Многолетняя селекция современных линий кур [11] это привела к повышению их продуктивности, но к снижению устойчивости к болезням и повышенной чувствительности к температурным перепадам [12]. Быстрорастущие и высокоэффективные цыплята-бройлеры [13], ставшие результатом около 70 лет генетического прогресса, отличаются еще большей уязвимостью к тепловому стрессу из-за высокого метаболизма и недостаточного развития сердечно-сосудистой и дыхательной систем [14]. Их особенности делают их особенно восприимчивыми к стрессу и связанным с ним метаболическим нарушениям.

Одним из инновационных подходов является использование электромагнитных воздействий (ЭМИ). Эта технология основана на воздействии электромагнитных полей различной интенсивности и частоты с целью стабилизации физиологических процессов у птиц. ЭМИ может оказывать благоприятное влияние на иммунную систему, повышая сопротивляемость организма к стрессам и инфекциям, а также снижая уровень кортизола -гормона стресса. Благодаря этим эффектам, птицы лучше адаптируются к неблагоприятным условиям, что способствует повышению их продуктивности, улучшению качества мяса и снижению необходимости использования медикаментов и антибиотиков.

Материалы и методы. Исследования выполняли в учебнопроизводственном птичнике РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева и лаборатории физиологии РГАУ МСХА имени К.А. Тимирязева в 2024 году. Объектом исследования являлись цыплята-бройлеры начиная с суточного и заканчивая 43-суточным возрастом, всего 80 цыплят. Эксперименты проводились в соответствии с нормами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в исследованиях и для научных целей (ETS 123, Страсбург, 1986). Исследователи и персонал руководствовались требованиями гуманного отношения к животным, при хирургических манипуляциях применялись седативные и обезболивающие средства. Для воздействия на цыплят опытной группы использовали аппарат неинвазивной электромагнитной терапии «ТОР» (производитель АО «Концерн ГРАНИТ»). Принцип обработки был основан на слабом неионизирующем нетепловом ЭМИ, непрерывно генерируемом высоковольтными импульсами амплитудой 5–8 кВ, которые способны воздействовать на pH изотонических растворов на дистанции до 700 м [15]. Частота импульсов составляла 100–150 Гц. Каждый волновой пакет с крутыми прямоугольными фронтами содержал частотные моды, кратные 25 кГц. Рабочая мощность прибора не превышала 80 Ватт, то есть была меньше мощности стандартной лампы накаливания в помещениях [16]. Воздействие на птицу производилось Аппаратом «ТОР», установленным на штатив на расстоянии 2 м от клетки с птицей с использованием спектра «Росток+». Обработку птицы осуществляли на протяжении всего периода выращивания в следующем режиме: 1-21 сутки - 3 мин - направленное воздействие электромагнитных излучений (ЭМИ), затем 57 мин - перерыв, 12 циклов с 08.00 до 20.00; 22-35 сутки - 3 мин воздействие/27 мин перерыв, 24 цикла с 08.00 до 20.00. Контрольная группа находилась вне зоны действия прибора.

Важным элементом исследования являлось то, что во все время проведения сохранялась жаркая погода, и цыплята подвергались воздействию теплового стресса, что позволило изучить воздействие ЭМИ на организм птицы в сложных стрессовых условиях, часто имеющих место на производстве.

Условия кормления и содержания. Цыплята были разделены на две группы, контрольную и опытную, случайным отбором. Кормление цыплят осуществлялось кормами производства ООО «Агроцентр». Корм для обеих групп (контрольной и опытной) был одинаковым, кормление производилось одновременно и в одинаковом объеме. В кормлении цыплят было 3 периода кормления: стартовый период (0-7 дн.), ростовой (8-28 дн.) и финишный - с 29 дня до убоя.

Методы исследования: Получение дуоденального содержимого у птицы. Фистулирование проводили в возрасте 20-22 суток, вживляя канюлю напротив впадения панкреатических и желчных протоков в кишечник, по авторской методике (Фисинин В.И., Вертипрахов В.Г., Грозина А.А., Кислова И.В., Кощеева М.В., 2019) [17]. В течение суток после операции птицу не кормили, а затем переходили на нормированное кормление, отслеживая прохождение химуса через кишечник. Швы снимались на пятые сутки. После операции птице предоставляли доступ к воде на 16-18 часов, при этом корм не давали.

Методы исследования: Лабораторные исследования. Биохимическое исследование химуса, полученного через фистулу, проводилось на 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 сутки. Взятие химуса проводилось дважды в день по 1 мл через фистулу: утром через 1 час после кормления, затем через 2 часа после кормления. Содержимое центрифугировалось на центрифуге Eppendorf MiniSpin plus для микропробирок 1,5/2,0 мл (Германия) при 5000 об/мин в течение 5 минут, надосадочная жидкость сразу же исследовалась. В качестве показателей для биохимического исследования были взяты ферменты: трипсин, щелочная фосфатаза, амилаза, липаза.

Для определения трипсина, щелочной фосфатазы, амилазы, кальций, фосфор использовался полуавтоматический биохимический анализатор Вiochem SA (США), реактивы High Technology, в соответствии с инструкцией анализатора для различных показателей. Активность трипсина определяли по методу Вертипрахова, Грозиной (2018) [18]. Для определения липазы использовался полуавтоматический биохимический анализатор BS-3000M (Китай), реактивы ДиаВетТест (Россия), в соответствии с инструкцией анализатора для различных показателей.

Биохимическое исследование крови проводилось на 29 и 41 сутки по 10 голов каждой группы. Взятие крови проводилось из подкрыльцовой вены, предварительно перья на месте процедуры удалялись, кожа обрабатывалась ватным тампоном со спиртом. Использовались инъекционные иглы размера 21G, 0,8Х40 мм. Для сбора крови использовались пробирки с активатором свертывания 13х100 мм 6мл (VacPlus, Китай). Сыворотка центрифугировалась на центрифуге Eppendorf MiniSpin plus для микропробирок 1,5/2,0 мл (Германия) при 5000 об/мин в течение 5 минут. Исследовались показатели: содержание кальция, фосфора и общего белка, глюкозы, активность трипсина, щелочной фосфатазы, амилазы, липазы, уровень холестерина и триглицеридов в плазме крови. Для определения трипсина, щелочной фосфатазы, амилазы, Ca, P использовался полуавтоматический биохимический анализатор Вiochem SA (США), реактивы High Technology, в соответствии с инструкцией анализатора для различных показателей. Для определения липазы использовался полуавтоматический биохимический анализатор BS-3000M (Китай), реактивы ДиаВетТест (Россия), в соответствии с инструкцией анализатора для различных показателей. Для определения глюкозы, мочевой кислоты, общего белка, триглицеридов, холестерина в крови использовался автоматический биохимический анализатор HTI BioChem FC-120 (США), реактивы High Technology, в соответствии с инструкцией анализатора.

Результаты и обсуждение. Птицы имеют высокий уровень метаболизма, что позволяет им поддерживать высокую активность и теплообмен. Пищеварение птиц характеризуется высокой активностью пищеварительных ферментов, причем переваривание трудногидролизуемых кормов частично осуществляется микробами в слепой и толстой кишке [19].

В нашем исследовании в условиях теплового стресса цыплята значительно отставали в росте и развитии от нормативов, установленных для данного кросса птицы [20]. Низкий аппетит и нарушение процессов пищеварения привели к снижению зоотехнических показателей. Однако воздействие электромагнитной обработки оказало заметное влияние на рост данных показателей в опытной группе, сократив разницу между экспериментальными цыплятами и нормативом для кросса (рисунок 1)

Контроль Опыт

Рисунок 1 - Показатели живой массы цыплят-бройлеров (m±SD, n=40)

На 41 день эксперимента (накануне убоя) разница по массе составляла 19,5%, по приросту - 20%, по потреблению корма - 9,16%, а по затратам корма на 1 кг прироста живой массы – 8,53%. Такую значительную разницу обуславливает рост активности пищеварительных ферментов в кишечнике цыплят опытной группы.

Поджелудочная железа играет ключевую роль в пищеварении, выделяя ферменты, которые гидролизуют питательные вещества до мономеров. Экзокринные секреты содержат два пула ферментов: синтезированные de novo и регенерированные. Исследования показали, что только 25-50% панкреатических ферментов синтезируется de novo. Сложнорефлекторная регуляторная фаза панкреатической секреции продолжается в течение 120 мин после кормления с последующим переходом в нейрогуморальную фазу (опосредованную секрецией гормонов секретина и холецистокинина в кровоток), когда химус достигает кишечника [9]. Ферменты поджелудочной железы, участвующие в кишечном пищеварении, затем в основном попадают в кровоток, и только незначительная часть активированных ферментов выводится с калом. Ферменты поступают в кровоток неравномерно.

Таблица 1 – Активность ферментов в химусе цыплят, ед/л (m±SD, n=10)

Сутки	Время
	1 час после кормления		2 часа после кормления
	Контроль	Опыт	Контроль	Опыт
Трипсин	140,95±43,16	155,10±32,14	139,85±4,67	154,77±31,24
Амилаза	3294,0±2264,16	4068,0±1346,01*	3530,0±230,52	9983,67±5115,47
Липаза	1512,1±454,6	1539,9±571,5	1219,8±121,3	2182,1±1384,8
Щелочная фосфатаза	3789±73,5	3238±1027,5	1908,5±210,0	4093±881,4*

*Примечание: Различия статистически значимы при p ≤ 0,05

Опытная группа демонстрирует увеличение активности трипсина в химусе и через час, и через два после кормления на ~10%. Активность амилазы на 41 день выращивания (накануне убоя) в опытной группе выше на 23,3% через час после кормления и на 182,8% через два часа после кормления, что говорит о доминировании нейрогуморальной фазы регуляции пищеварения. Активность липазы также выше в опытной группе – на 78,9% через два часа после кормления. Уровень щелочной фосфатазы в опытной группе через час после кормления ниже на 14,5%, а через два часа – выше на 114,5%.

Эти данные говорят о значительном росте активности пищеварительных ферментов в опытной группе под влиянием электромагнитного облучения. Затем эти ферменты всасываются в кровоток, поступают с кровью в поджелудочную железу и секретируются в кишечник повторно, не распадаясь в кишечнике до аминокислот.

Результаты исследований показали, что активность трипсина в сыворотке крови опытных цыплят на 9,9% выше на 41 день, что хорошо коррелирует с более высоким содержанием в химусе и более интенсивным ростом опытных цыплят, лучшим усвоением корма. В нашем опыте концентрация липазы в сыворотке крови опытных цыплят на 8,7% выше, чем у контрольных, что свидетельствует о более раннем и активном развитии секреторной функции поджелудочной железы и улучшенной усвояемости жировых кормов. В ходе нашего опыта у контрольных цыплят уровень амилазы в крови постепенно повышался до 41 дня, что, вероятно, отражало их меньшую физиологическую зрелость. В то же время у опытной группы наблюдался рост уровней амилазы до 29 дня с последующим снижением к 41 дню. Такой тренд свидетельствует о более раннем и выраженном повышении ферментативной активности в ответ на развитие кишечного пищеварения: у опытных цыплят уровень амилазы на 29 сутки был выше. Уровень щелочной фосфатазы в сыворотке крови у контрольной группы на 17% выше, чем у опытных птиц. Повышенные показатели у контрольных птиц могут указывать на усиленную клеточную гибель или более активные процессы ремоделирования тканей. В то же время у опытных цыплят отмечается более низкий уровень этого фермента, что может свидетельствовать о более ранней и гармоничной зрелости организма.

Таблица 2 – Активность ферментов, биохимические показатели в крови цыплят-бройлеров (m±SD, n=10)

Показатель	Группы
	контрольная	опытная
29 сутки
Трипсин, г/л	43,6±0,94	46,0±1,26
Амилаза, ед/л	604,00±91,52	670,75±155,09
Липаза, ммоль/л	-	-
Щелочная фосфатаза, ед/л	3010,0±692,1	2960,0±437,3
Общий белок, г/л	40,5±1,33	37,7±2,65
Глюкоза, ед/л	11,5±0,31	12,6±0,48
Триглицериды, ммоль/л	0,5±0,07	0,5±0,18
Холестерин, ммоль/л	4,0±0,01	3,5±0,03*
Мочевая кислота, ммоль/л	115,8±13,27	114,8±13,75
41 сутки
Трипсин, г/л	61,54±8,76	67,62±6,99
Амилаза, ед/л	876,50±216,84	649,25±120,65
Липаза, ммоль/л	-	-
Щелочная фосфатаза, ед/л	6433,3±1447,2	4002,5±706,8**
Общий белок, г/л	42,9±1,57	43,7±3,35
Глюкоза, ед/л	14,2±0,68	14,1±0,32
Триглицериды, ммоль/л	0,6±0,11	0,9±0,20*
Холестерин, ммоль/л	4,0±0,01	4,7±0,29*
Мочевая кислота, ммоль/л	211,8±19,96	195,7±65,49

*Примечание: Различия статистически значимы при p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01

У опытной группы уровень общего белка в крови был на 7% ниже на 29-й день, чем у контрольных цыплят, уравниваясь с контрольной группой к 41 дню. Такой показатель может отражать более эффективную и зрелую регуляцию обменных процессов, особенно учитывая рост функциональности пищеварительной системы и активное участие белковых ферментов в метаболизме.

Особенно яркое увеличение уровня триглицеридов - на 70% относительно уровня на 29 день - отмечается у птиц опытной группы, что составляло в целом на 46% больше по сравнению с контрольной группой, и коррелировало с более высоким содержанием липазы (на 46%) в пищеварительном соке, усиливая гидролиз жиров и их всасывание. Что касается холестерина, его уровень в крови опытных цыплят на 3% превышал показатели контрольных.

Таким образом, повышение липидного обмена у опытной группы связано с более активной ферментативной регуляцией и более эффективным гидролизом жиров.

Содержание мочевой кислоты в крови опытной группы было меньше на 8,2% на 41-й день, что говорит о более эффективной переработке и утилизации азотистых продуктов метаболизма. Можно предположить, что благодаря ускоренной ферментативной активности и более эффективной функции пищеварительной системы, цыплята лучше справляются с метаболическими отходами.

В крови опытных кур было на 3,4% больше содержание глюкозы, что может свидетельствовать о более активной глюконеогенной и глюкозотрансформирующей функции организма, что способствует обеспечению энергией процессов роста и развития. В контексте повышения ферментативной активности (амилазы, липазы, щелочной фосфатазы, трипсина) это может означать, что электромагнитное воздействие способствует более эффективному превращению питательных веществ, увеличивая доступность глюкозы для тканей. Также, умеренное повышение глюкозы может быть признаком улучшения метаболической регуляции и более высокой энергетической обеспеченности организма в ответ на стимуляцию ферментами.

Выводы. В условиях теплового стресса отмечается существенное угнетение пищеварительных процессов у птиц, что негативно сказывается на их продуктивности. Обработка цыплят электромагнитным излучением показывает положительный эффект: в опытной группе наблюдается увеличение активности ферментов в химусе и крови, что свидетельствует о более эффективной работе пищеварительной системы.

Повышение активности ферментов в дуоденальном химусе сопровождается повышением активности ферментов в крови, что подтверждает данные о всасывании панкреатических ферментов в кровь и важном значении нейрогуморальной регуляции пищеварения.

Повышение ферментативной активности сопровождается ростом содержания триглицеридов и более эффективной переработкой азотистых продуктов, что свидетельствует о более зрелой и регуляторно устойчивой метаболической системе. В целом, электромагнитное воздействие способствует усилению обменных процессов, улучшая адаптацию и рост цыплят в стрессовых условиях.