Особенности биохимических и иммунологических нарушений при хронических вирусных гепатитах В и С у детей



В ПОМОЩЬ ПРАКТИЧЕСКОМУВРАЧУ

Н.А. Каплина, Е.И. Шабунина, Е.А. Жукова, С.В. Романова, Н.И. Толкачева, В.И. Ашкинази, И.А. Тимченко

E-mail: kaplinanatali@list.ru

ОСОБЕННОСТИ БИОХИМИЧЕСКИХ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ В И С У ДЕТЕЙ

ФГУ «Нижегородский НИИ детской гастроэнтерологии Росмедтехнологии», г. Нижний Новгород

Хронические вирусные гепатиты продолжают занимать важное место в структуре заболеваний органов пищеварения у детей и остаются одной из социально значимых проблем здравоохранения из-за высокой распространенности и неуклонного увеличения числа больных, развития тяжелых осложнений в виде цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы, возможности летальных исходов [1].

В настоящее время в мире насчитывается более 500 млн. носителей вирусов гепатитов В и С (HBV и HCV), около 200 млн приходится на хронический гепатит С [2]. Доля гепатита В в структуре острых гепатитов у детей постоянно снижается в связи с проведением вакцинации и в настоящее время составляет не более 5-10%, однако в структуре хронических гепатитов HBV-инфекция по-прежнему доминирует, составляя около 50% [3]. В России более 7 млн человек являются носителями HBV и HCV. В связи с высокой степенью хронизации ожидается 4-кратное увеличение числа больных хронической HCV-инфекцией к 2015 году [4].

Общепризнанно, что клиническое течение и исход вирусного гепатита обусловлены не только патогенными свойствами инфицирующего агента, но и реакцией системы иммунитета организма человека на вирус [5]. Именно различие иммунного ответа на антигены вирусов гепатитов в ткани печени определяет широкий спектр вирусных поражений – от бессимптомного носительства до цирроза печени и гепатоцеллюлярного рака.

Иммунные реакции при вирусной инфекции могут быть разделены на врожденные, обусловленные системой комплимента, мононуклеарными фагоцитами и естественными киллерами, и адаптивные, формирующиеся в процессе ответа на специфические антигены. Важнейшая особенность адаптивной системы иммунитета – избирательное вовлечение в иммунный ответ только тех лимфоцитов, которые несут рецепторы, распознающие антигены [6].

CD4 Т-клеточный ответ на вирусные белки является важным механизмом защиты макроорганизма, поскольку CD4-клетки – Т-хелперы стимулируют продукцию антител В-лимфоцитами и активируют CD8 Т-клетки, специфичные для вирусинфициро-ванных клеток. CD8–цитотоксические Т-лимфоциты постоянно обнаруживаются у больных с хроническим гепатитом и могут оказывать повреждающее действие на клетки печени [7].

Содержание натуральных киллеров CD16 у детей с хроническим гепатитом представляет значительный интерес, поскольку именно данный тип клеток обусловливает антителонезависимую цитотоксичность [8]. По результатам ряда работ у больных с хроническим гепатитом выявляется низкая экспрессия антигена CD16, что может свидетельствовать о слабой противовирусной резистентности макроорганизма.

Существенная роль отводится нарушению баланса цитокинов Th1/Th2 в иммуногенезе хронических гепатитов [9, 10]. Цитокины участвуют в регуляции воспалительной реакции ткани печени, апоптоза и некроза ее клеток, развитии холестаза и фиброза [11]. Цитокины 1-го типа, вырабатываемые Th1 – γ -интерферон (ИФН- γ ), интерлейкин-2, фактор некроза опухоли α и β (ФНО- α , ФНО- β ), принимают участие в клеточном иммунном ответе и ассоциируются с защитным антивирусным эффектом [12]. В то же время преобладание цитокинов 2-го типа, секретируемых Th2 – интерлейкинов (ИЛ) 4,5,6,10,13, которые усиливают гуморальный иммунный ответ, может вести к утяжелению течения заболевания и переходу его в хроническую форму. По функциональной активности цитокины разделяют на провоспалительные (ИЛ-1 β , ФНО- α , ИНФ- γ ) и противоспалительные (ИЛ-4, ИЛ-10). Повреждение печеночной ткани с развитием фибротических и некротических изменений связано с воспалительными изменениями в ткани органа и уровнем продукции провоспалительных цитокинов [9]. ИЛ-1 β и ФНО- α способны активировать звездчатые клетки печени, играющие ключевую роль в фиброгенезе печени. Повышение уровня ФНО- α характеризует процессы воспаления и элиминации клеток путем прямой цитотоксичности или апоптоза [13]. Отмечается и более высокий уровень ряда цитокинов при прогрессировании хронического процесса и формировании цирроза, что позволяет использовать 83

эти показатели для оценки степени тяжести и прогнозирования течения болезни, а также косвенно судить о степени выраженности тканевого поражения [14].

Таким образом, иммунные нарушения при хронических вирусных гепатитах В и С имеют патогенетическое значение и играют важную роль в прогрессировании хронического процесса в печени.

В настоящее время в литературе широко представлено изучение иммунного статуса и продукции цитокинов у взрослых больных хроническим вирусным гепатитом, вместе с тем эта проблема недостаточно изучена у детей с хроническим гепатитом В и С. Отсутствуют работы, посвященные комплексной оценке иммунных показателей во взаимосвязи с изменениями клинических и биохимических параметров, что явилось основанием для проведения настоящего исследования.

Цель нашего исследования – выявление особенностей изменения клинических, биохимических, иммунологических показателей у детей с хроническими вирусными гепатитами В и С в зависимости от активности воспалительного процесса в печени.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследования проведены у 55 детей c хроническим вирусным гепатитом В и С (ХГВ и ХГС) в возрасте от 6 до 17 лет. Из них с вирусным гепатитом В – 31 больной, с вирусным гепатитом С – 24 ребенка. Контрольную группу составили 25 здоровых детей в возрасте от 6 до 17 лет. Средняя давность заболевания ХГВ и ХГС – 7 лет.

Диагноз хронического гепатита устанавливали на основании клинических и общепринятых лабораторно-инструментальных исследований. Маркеры HВV и HСV в сыворотке крови определяли им-муноферментным анализом (ИФА) с использованием наборов «Диагностические системы» (г. Н. Новгород). У всех больных исследовали в крови ДНК и РНК вирусов вирусов гепатитов В и С методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для оценки функционального состояния печени проводили определение ряда биохимических показателей в сыворотке крови – белковых фракций с помощью электрофореза на бумаге, тимоловой пробы (ТП) по методу Маклагана, аланин- и аспартатаминотрансферазы (АЛАТ и АСАТ) по методу Френкеля в модификации Райтмана, активности щелочной фосфотазы (ЩФ) [15], гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) [16], холинэстеразы (ХЭ) [17] биотестами LaChema, восстановленной фракции глютатиона (ГВ) титрометрическим методом по Будворду-Фрей и сравнивали с показателями здоровых детей [18]. При оценке степени активности заболевания учитывалась выраженность отклонений от нормы показателей цитолиза (АЛАТ, АСАТ). Для 1-й (минимальной) степени активности патологического процесса в печени характерны незначительные изменения показателей цитолиза, превышающие норму не более чем в 1,5-2 ра-84

за. Для 2-й (умеренной) – увеличение показателей относительно нормы в 2-4 раза, 3-й и 4-й степеней (высокой и максимальной) – соответственно в 4-6 и более раз. В зависимости от степени активности заболевания были выделены 3 группы больных: 1-я группа – 24 ребенка (14 с ХГВ и 10 с ХГС) без признаков биохимической активности, 2-я – 22 (12 с ХГВ и 10 с ХГС) с минимальной активностью и 3-я – 9 детей (5 c ХГВ и 4 с ХГС) с умеренной активностью.

Поверхностные антигены CD3, CD4, CD8, CD16, CD19 на лимфоцитах периферической крови исследовали иммуноцитохимическим методом (DAKO, Дания).

Состояние гуморального иммунитета изучалось по уровню сывороточных Ig класса A, M, G, определяемых методом простой иммунодиффузии в геле по Манчини, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) по методу В. Гашковой в модификации Б.А. Молотилова [19].

Исследование цитокинов в сыворотке крови: ИЛ- 1 β , ФНО- α , ИЛ-6, ИЛ-10, ИНФ- γ проводили методом ИФА с помощью тест-системы «Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург).

Постановку всех реакций осуществляли в соответствии с инструкциями фирм-изготовителей.

Полученные результаты обработаны статистически с помощью пакета прикладных программ STATISTICA, BIOSTAT с получением следующих характеристик: средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m). Критический уровень значимости (р) при проверке гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клиническая картина у большей части больных независимо от активности патологического процесса в печени проявлялась астеновегетативным и болевым синдромами. Большинство детей предъявляли жалобы на вялость, слабость, быструю утомляемость, снижение аппетита, тяжесть и периодические боли в области правого подреберья. При осмотре выявлялась нерезко выраженная гепатомегалия (увеличение печени на 1-2 см из-под края реберной дуги), которая статистически значимо чаще встречалась у детей с умеренной активностью заболевания по сравнению с группой детей, имевших неактивный гепатит, а именно: в 1-й группе – у 12 из 24 (50%) во 2-й – у 16 из 22 (73%), в 3-й группе – у 8 из 9 (89%) больных (р=0,036). Спленомегалия наблюдалась лишь в единичных случаях. Внепеченочные проявления в виде пальмарной эритемы и телеангиоэктазий имели место с одинаковой частотой во всех группах (табл. 1).

Основным биохимическим синдромом ХГВ и ХГС являлся цитолитический, который имел место у 56% больных, при этом уровень АЛАТ и АСАТ превышал норму в 2-4 раза. Преобладали дети с отсутствием биохимической активности – 44% и дети с минимальной активностью – 41%. Умеренная активность

Таблица 1

Частота клинических проявлений у детей с ХГВ и ХГС в зависимости от активности воспалительного процесса в печени (Р±т,%)

Клинические синдромы	Больные ХГВ и ХГС
	без активности, n=24		с минимальной, n=22		с умеренной, n=9		р
	абс.	Р±m,%	абс.	Р±m,%	абс.	Р±m,%	>0,2
Астеновегетативный синдром	15	62±10	17	77±9	7	78±15	>0,2
Болевой синдром	7	29±9	8	36±10	5	56±18	>0,2
Гепатомегалия	12	50±10	16	73±10	8	89±11	0,036
Спленомегалия	1	4±4	3	14±7	1	11±11	>0,2
Пальмарная эритема	6	25±9	7	32±10	3	33±17	>0,2
Телеангиоэктазии	5	21±8	7	32±10	3	33±17	>0,2

Примечание: р – достигнутый уровень значимости различий показателей у детей без активности и с умеренной активностью.

наблюдалась только у 15% детей с ХГВ и ХГС. Следует отметить, что высокая и максимальная биохимическая активность не определялась ни у одного больного, что может быть связано с большой давностью заболевания и его латентным течением.

В то же время биохимические изменения у большинства больных ХГВ и ХГС характеризовались нормальным средним содержанием глутатиона, восстановленного активностью щелочной фосфотазы, холинэстеразы, гамма-глутамилтранспептидазы. Наибольшие изменения показателей синдрома мезенхимального воспаления (гаммаглобулины, тимоловая проба) наблюдались при умеренной активности воспалительного процесса. Они были повышены в 1-й группе – у 4 (17%) и 3 (12%), во 2-й – у 9 (41%) и 9 (41%), в 3-й – у 5 (56%) и 8 (89%) больных соответственно. Статистически значимое повышение средних значений показателей гаммаглобулинов относительно здоровых детей отмечено у пациентов 2-й и 3-й групп (р=0,006; р=0,002), тимоловой пробы – у больных в 3-й группе (р=0,000). Выявлена статистическая значимость изменений этих показателей между детьми 1-й и 3-й групп (р=0,0018; р=0,000). Нарушение белково-синтетической функции печени в виде гипоальбуминемии было также более выражено у больных 2-й и 3-й групп. При отсутствии активности она отмечалась у 10 (42%), что было значительно реже, чем при минимальной – у 12 (55%) и умеренной активности – у 7 (78%) детей (р=0,025; р=0,031). Таким образом, выявленные изменения основных биохимических показателей увеличивались по интенсивности и частоте встречаемости по мере нарастания активности патологического процесса в печени (табл. 2).

У всех больных хроническим гепатитом в крови были обнаружены ДНК или РНК вирусов гепатитов В и С.

Состояние Т-клеточной системы иммунитета у больных хроническим гепатитом характеризовалось ее угнетением со снижением содержания CD3, CD4, CD8-клеток у большинства пациентов независимо от активности воспалительного процесса в печени в 1-й группе – у 21 (87%), 20 (83%), 17 (71%) пациентов, во 2-й – у 19 (86%), 15 (68%), 20 (91%) детей, в 3-й – у 8 (89%), 6 (67%), 7 (78%) больных соответственно. Экспрессия поверхностных антигенов этих клеток статистически значимо отличалась от показателей здоровых детей во всех группах (р=0,000 – р=0,025) (табл. 3). Это свидетельствует о неспособности организма к быстрому и качественному иммунному ответу, ограничивающему распространение инфекции, что приводит к активной репликации вирусов и возможности трансформации хронического гепатита в цирроз печени.

Таблица 2

Биохимические показатели крови детей с ХГВ и ХГС в зависимости от активности воспалительного процесса в печени (М±т)

№	Группы детей		Альбумин, %	Гамма-глобулин, %	Тимоловая проба, ед.
1	и и и т И о в ^ ц о и	без активности, n=24	60,2±0,68	15,5±0,50	2,3±0,31
2		с минимальной, n=22	58,6±0,71	17,1±0,71	4,4±0,67
3		с умеренной, n=9	55,8±1,43	19,7±1,78	7,7±1,20
4	Здоровые дети, n=15		64,0±2,11	14,0±0,84	4,1±0,41
	р		р2-4=0,025 р3-4=0,031 р1-3=0,032	р2-4=0,006 р3-4=0,002 р1-3=0,018	р3-4=0,000 р1-3=0,000 р2-3=0,02

Таблица 3

Показатели экспрессии поверхностных маркеров Т- и В-лимфоцитов крови детей с ХГВ и ХГС в зависимости от активности воспалительного процесса (%, М±т)

№	Группы детей		СD3	CD4	CD8	CD16	CD19
1	Больные ХГВ и ХГС	без активности, n=24	53,7±1,14	34,5±1,64	19,4±1,56	21,6±1,68	24,3±0,93
2		с минимальной, n=22	53,9±1,32	37,6±1,61	17,1±1,91	23,8±1,32	24,3±1,10
3		с умеренной, n=9	52,0±2,08	35,7±2,18	16,4±2,71	24,3±3,90	23,2±1,08
4	Здоровые дети, n=15		62,2±0,92	41,6±0,80	24,2±0,53	12,7±0,66	17,8±0,92
	р		р1-4=0,000 р2-4=0,000 р3-4=0,000	р1-4=0,000 р2-4=0,025 р3-4=0,003	р1-4=0,003 р2-4=0,000 р3-4=0,000	р1-4=0,000 р2-4=0,000 р3-4=0,000	р1-4=0,000 р2-4=0,000 р3-4=0,002

Напротив, содержание CD16 было повышенным относительно показателя здоровых детей у большинства пациентов: в 1-й группе – у 20 (83%), во 2-й – у 20 (91%), в 3-й – у 9 (100%) больных (р=0,000; р=0,000; р=0,000). Обращало на себя внимание преобладание высоких значений CD16 у больных хроническим гепатитом как при отсутствии активности, так и при умеренных ее значениях.

Наряду с нарушениями клеточного иммунитета выявлены значительные изменения гуморального звена. У детей с ХГВ и ХГС наблюдалось статистически значимое повышение как относительного, так и абсолютного числа CD19- клеток независимо от выраженности синдрома цитолиза: в 1-й группе – у 18 (75%), во 2-й – у 19 (86%), в 3-й – у 7 (78%) больных (р=0,000; р=0,000; р=0,002), что свидетельствует об активном участии В-лимфоцитов в противовирусном иммунном ответе.

В отличие от показателей клеточного иммунитета изменения в эффекторном звене гуморального иммунитета имели связь с показателями активности заболевания. Содержание сывороточных иммуноглобулинов класса А, М, G у больных хроническим гепатитом существенно не изменялось. Так, при отсутствии и минимальной активности воспалительного процесса их уровень не отличался от нормы, однако при умеренной наблюдалось некоторое увеличение Ig А, М, G в 2,5, 1,5 и 1,2 раза.

Вместе с тем необходимо отметить значительное повышение уровня ЦИК у большинства обследуемых больных при нарастании активности процесса. Наблюдалось статистически значимое его увеличение по сравнению с показателями здоровых детей: в 1-й группе – у 17 (71%), во 2-й – у 19 (86%), в 3-й – у 9 (100%) детей (р=0,000; р=0,000; р=0,000), что приводит к повышению синтеза аутоантител и развитию аутоиммунных повреждений тканей. У детей с отсутствием активности показатель ЦИК был статистически значимо ниже и составил 202,5±7,81 мкг/мл относительно детей с умеренным цитолизом 324,2±41,84 мкг/мл (р=0,0025). Это указывает на значительную интенсивность иммунных реакций гуморального типа против чужеродных антигенов – вирусов, более выраженную 86

при повышении активности воспалительного процесса в печени.

Таким образом, отчетливое изменение иммунологических параметров наблюдалось при ХГВ и ХГС как с наличием активности процесса 1-й и 2-й степеней, так и при неизмененных функциональных пробах печени, что свидетельствует о наличии глубоких дисрегуля-торных сдвигов в системе клеточного и гуморального иммунитета у больных хроническим гепатитом и требует пересмотра терапевтического подхода к больным с нормальными значениями ферментов.

У детей с хроническими вирусными заболеваниями печени выявлены также выраженные изменения в содержании и соотношении про- и противовоспалительных цитокинов в зависимости от активности патологического процесса.

Концентрация ИЛ-1 β , ФНО- α , ИЛ-6 была статистически значимо увеличена по сравнению с уровнем здоровых детей: в 1-й группе – у 17 из 21 (81%), 13 из 20 (65%), 16 из 23 (70%), во 2-й – у 16 из 20 (80%), 16 из 21 (76%), 17 из 18 (94%), в 3-й – у 8 из 8 (100%), 7 из 7 (100%), 7 из 7 (100%) больных соответственно (р=0,000 – р=0,04) (табл. 4), что указывает на существенную роль данных цитокинов в осуществлении механизмов противовирусной защиты, о чем свидетельствуют и данные литературы [9,13]. Повышенный уровень данных цитокинов в группе детей с отсутствием биохимической активности можно расценивать как ранний признак активно текущего воспалительного процесса.

Следует отметить, что средний показатель ИЛ-1 β был статистически значимо ниже у детей с неактивным гепатитом по сравнению с больными с умеренной активностью процесса (р=0,0028). Уровень ФНО- α также имел статистически значимую тенденцию к повышению при нарастании синдрома цитолиза в сравнении между показателями больных 2-й и 3-й групп (р=0,0038). Таким образом, частота встречаемости изменений цитокинового профиля и их степень возрастают пропорционально степени активности воспалительного процесса и повреждения печени при хронических вирусных гепатитах.

Определенный интерес представляет изменение содержания ИЛ-6 в сыворотке крови обследуемых

Таблица 4

Концентрация цитокинов в сыворотке крови детей с ХГВ и ХГС в зависимости от активности воспалительного процесса (пг/мл, М±т)

№ Группы детей ИЛ-1β ФНО-α ИЛ-6 ИЛ-10 ИФН-γ 1 Больные ХГВ и ХГС без активности 190,7±37,71 n=21 191,0±43,74 n=20 60,0±16,61 n=23 18,9±4,18 n=16 95,3±13,22 n=9 2 с минимальной 262,1±65,32 n=20 124,0±23,12 n=21 152,0±36,43 n=18 18,6±4,17 n=18 60,7±3,30 n=14 3 с умеренной 685,9±185,10 n=8 314,4±61,20 n=7 66,5±11,51 n=7 28,6±6,05 n=8 69,1±7,46 n=7 4 Здоровые дети, n=15 32,7±5,53 44,2±2,04 15,9±1,01 18,3±1,03 156,0±18,61 р р1-4=0,01 р2-4=0,005 р3-4=0,000 р1-3=0,0028 р2-3=0,0183 р1-4=0,007 р2-4=0,002 р3-4=0,000 р2-3=0,0038 р1-4=0,04 р2-4=0,002 р3-4=0,000 р1-2=0,0013 р1-4=0,003 р2-4=0,000 р3-4=0,006 р1-2=0,0043 больных. По данным литературы, ИЛ-6 подавляет выработку ИЛ-1β и ФНО. Это характеризует его двойственную роль в развитии воспаления: являясь по своей природе типичным провоспалительным цитокином, он оказывает также противовоспалительное действие, ограничивая выработку других провоспа-лительных цитокинов [20]. Нами установлено статистически значимое снижение концентрации ИЛ-6 в 1-й группе больных по сравнению со 2-й группой (р=0,0013). По-видимому, при отсутствии активности воспалительного процесса выработка ИЛ-6 невелика из-за сниженной активации клеток-продуцентов. У детей в 3-й группе уровень данного цитокина также был снижен в 2,2 раза по сравнению со 2-й группой. Очевидно, при повышении биохимической активности и концентрации ИЛ-1β, ФНО-α пониженная выработка ИЛ-6 связана с ослаблением функциональной способности клеток иммунной системы, продуцирующих этот цитокин, при утяжелении заболевания.

К противовоспалительным механизмам относится действие ИЛ-10, который ингибирует избыточную продукцию провоспалительных цитокинов. Содержание ИЛ-10 в сыворотке крови статистически значимо не отличалось от такового в контроле ни в одной из выделенных групп больных. Однако у детей 1-й и 2-й групп показатель ИЛ-10 был в 1,5 раза ниже и встречался реже у 6 из 16 (37%) и у 6 из 18 (33%), чем у больных 3-й группы у 5 из 8 (62%) (табл. 4). Нормальные средние значения ИЛ-10 при патологии свидетельствуют о дисбалансе цитокиновой системы с преобладающим влиянием провоспалительных цитокинов по сравнению с противоспалительными и соответственно поддержания иммунопатологического каскада клинико-лабораторных и морфологических изменений при хронических гепатитах [9].

В настоящее время доказана важная роль интерферонов в формировании противовирусной защиты организма [13]. При ХГВ и ХГС преобладал низкий уровень ИНФ- γ у детей во всех группах: в 1-й – у 8

из 9 (89%), во 2-й – у 14 из 14 (100%), в 3-й – у 7 из 7 (100%) больных (р=0,03; р=0,000; р=0,006). Наши данные указывают на более выраженные его изменения при нарастании активности заболевания со статистически значимой разницей между 1-й и 2-й группами детей (р=0,0043). Полученные результаты характеризуют нарушение механизмов интерфероно-вой регуляции иммунной системы, в том числе и при неактивном гепатите, что определяет недостаточную защищенность интактных гепатоцитов и приводит к длительному течению заболевания.

ВЫВОДЫ

• 1.    При хронических вирусных гепатитах В и С у детей имеют место выраженные нарушения клеточного, гуморального звеньев иммунитета, дисбаланса цитокинового профиля с повышением уровня ИЛ-1 β , ФНО- α , ИЛ-6, дефицитом ИФН- γ даже при неактивном воспалительном процессе в печени.

• 2.    Из всех изученных иммунологических тестов наибольшую зависимость с биохимическими параметрами имеют ЦИК, ИЛ-1 β , ФНО- α , что позволяет использовать эти показатели для дополнительной оценки воспалительной активности в печени.

• 3.    Сохранение иммунных нарушений при неизмененных традиционных биохимических критериях активности хронических вирусных гепатитов свидетельствует о глубоких сдвигах в иммунном гомеостазе, незавершенности патологического процесса в печени и необходимости проведения иммунокоррегирующей терапии.