Особенности физиологического статуса свиней при использовании наноинкапсулированных пробиотиков и селенсодержащих препаратов

Из множества различных препаратов, применяемых в животноводстве в качестве балансирующих кормовых добавок, регулирующих пищеварение и в целом обменные процессы в организме, в последние годы особое внимание стали уделять пробиотикам, что связано с их уникальными и многосторонними свойствами [6, 11]. Пробиотики способны подавлять патогенную и условно патогенную микрофлору за счёт продукции биологически активных веществ, они участвуют в нормализации моторики желудочнокишечного тракта, в образовании аминокислот и процессах всасывания [7, 8, 9, 10].

Известно также, что пробиотическая микрофлора детоксицирует соли тяжёлых металлов за счёт перевода их в нетоксические соединения, инактивирует попадающие извне или образующиеся в организме потенциальные токсические продукты, в том числе и канцерогены [3, 14].

Важной особенностью пробиотиков является способность предотвращать прикрепление патогенной микрофлоры к эпителию слизистой оболочки кишечника, её нейтрализации путём агглютинации, бактериостаза и других бактерицидных механизмов [16]. Поэтому пробиотики используют не только для восстановления микрофлоры кишечника, но и с целью профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных [1, 2, 4, 12, 15].

Несмотря на то, что количество пробиотических препаратов с каждым годом увеличивается, многие вопросы, связанные с их применением в животноводстве, остаются неизученными. Необоснованные дозировки, безсистемное применение без учёта взаимоотношений пробиотической микрофлоры и макроорганизма зачастую приносит не пользу, а вред.

Имеются новые данные [5], указывающие на то, что остаточные количества пробиотических микроорганизмов, которые достигают толстого отдела кишечника в жизнеспособном состоянии, являются чужеродными для естественной микрофлоры.

Немаловажной задачей для исследователей является получение пробиотических препаратов, устойчивых к кислой среде желудка животных. Пробиотические микроорганизмы, попадая в желудок, испытывают действие соляной кислоты и ферментов, находящихся в желудочном соке.

Экспериментально подтверждено, что количество колониеобразующих единиц после прохождения пробиотиком желудка снижается на 4-6 порядков, и в кишечник с его благоприятной средой попадает лишь незначительная часть пробиотических микроорганизмов, способных образовывать жизнеспособные колонии [13].

Для защиты пробиотиков от «агрессивной» среды желудка в медицинской практике применяются капсулированные пробиотические препараты с использованием желатиновых или полимерных капсул. Однако перспектива их использования в животноводстве и ветеринарной медицине не высокая, так как данные препараты имеют относительно высокую стоимость и требуют индивидуального введения.

Принимая во внимание актуальность и научно-практическую значимость указанной проблемы, целью наших исследований являлось изготовление нанокапсулированного препарата и изучение его влияния на физиологический статус свиней.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили на кафедре органической и аналитической химии ЮгоЗападного государственного университета (ЮЗГУ), кафедре терапии и акушерства Курской ГСХА и лечебно-диагностическом Центре Орловского ГАУ. Работа состояла из трёх экспериментов.

Во время первого эксперимента был изготовлен нанокапсулированный препарат, условно названный нами «ВетСел», который включал в свой состав пробиотик «Ветом 1.1» и селенсодержащий препарат «Сел-Плекс». Пробиотик «Ветом 1.1» представляет собой комплекс бактерий Bacillussubtilis рекомбинантного штамма ВКПМ В-10641, а препарат «Сел-Плекс» - органическую форму селена (селенометионин и селеноцистеин).

Подбор основных частей препарата «ВетСел» был не случайным, пробиотик «Ветом 1.1» и селенсодержащий препарат «Сел-Плекс» обладают уникальными биологическими свойствами, дополняющими друг друга.

Нанокапсулирование препарата проводили по технологии, разработанной профессором А.А. Кралевцом (ЮЗГУ). Физическую оценку препарата «ВетСел» осуществляли с использованием атомно-силовой сканирующей электронной микроскопии. Биологические свойства препарата определяли на лабораторных животных и беспородных собаках согласно Методическим рекомендациям «Оценка безопасности наноматериалов (приказ Роспотребнадзора № 280 от 12.10.2007).

Второй эксперимент был посвящен определению свойств препарата «ВетСел» в условиях in vitro, моделирующих пищеварение в организме свиней. Для этого при убое свиней отбирали содержимое желудка и тонкого отдела кишечника и подвергали его пресс-фильтрации, фильтрации через марлево-ватный фильтр и центрифугированию. Полученный центрифугат пропускали под давлением последовательно через керамический и стеклянный бактериальные фильтры.

В пробирке с фильтратами содержимого из различных участков желудочнокишечного тракта свиней вносили 1 дозу препарата «ВетСел» и проводили инкубацию при 37°С в течение 4 и 12 часов. После инкубации подсчитывали общее количество бактерий в камере Горяева.

В третьем научно-производственном эксперименте изучали физиологический и биохимический статус у свиней после скармливания препарата «ВетСел». Исследования проводили в ООО «Надежда» Курской области и ЗАО свинокомплекс «Ивановский» Белгородской области. Было сформировано три группы поросят 2месячного возраста с соблюдением принципа аналогов. Поросятам первой опытной группы скармливали препарат «ВетСел». Поросята второй опытной группы получали препараты «ВетСел» и «Сел - Плекс». Поросята третьей группы являлись контролем. Животные всех групп находились в одинаковых условиях и получали одинаковый рацион.

У животных всех групп в 2 и 6-месячном возрасте брали кровь, в которой определяли содержание биохимических компонентов с использованием наборов реактивов «Био-Ла-Тест» и «Клини-Тест», а также биохимического анализатора ILAB-650.

В 6 месяцев в каждой группе было убито по 3 животных. После убоя отбирали пробы тканей печени, длиннейшей мышцы спины и стенки тонкого отдела кишечника для биохимического анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты первого эксперимента показали, что каждая нанокапсула представляет собой «контейнер» сферической, или близкой к ней, формы (рис.1), состоящий из оболочки и внутреннего содержимого (пробиотика и селенсодержащего препарата).

Рисунок 1 - Схематическое изображение структуры нанокапсулы препарата «ВетСел»

Исследование поверхности капсул с использованием атомно-силового сканирующего электронного микроскопа, совмещённого с конфокальной микроскопией на микроспектрометре Omega Scope, показало, что поверхность нанокапсул имеет неоднородную структуру, что значительно увеличивает её рабочую поверхность.

Попадая в водный раствор, нанокапсулы, при их достаточно низкой концентрации, создают фрактальные композиции, обладающие самоорганизацией. При этом исследования показали, что образование нанокапсул происходит спонтанно за счёт нековалентных взаимосвязей, это свидетельствует о характерной для нанокапсул самосборке. Следовательно, инкапсулированные препараты обладают супрамолекулярными свойствами.

Исследования фармакокинетических свойств нанокапсулированного препарата, проведённые на лабораторных животных и собаках, показали, что он не токсичен, не вызывает аллергических реакций и других побочных действий.

В ходе проведения второго эксперимента было установлено, что после 4-часовой инкубации в фильтрате содержимого из желудка пробиотические бактерии не обнаруживались (рис. 2). При инкубации фильтрата содержимого кишечника после внесения в него препарата «ВетСел» через 4 часа обнаруживалось 1,0·105 бактерий.

Рисунок 2 - Схема локализации нанокапсулированного препарата «ВетСел» в желудочно-кишечном тракте свиньи

Разумеется, созданная нами модель in vitro не может полностью соответствовать физиологическому состоянию желудочно-кишечного тракта животного в естественных условиях, тем не менее, полученные результаты указывают на то, что кислоустойчивые нанокапсулы в желудочном соке разрушаются в незначительном количестве. Однако, попав в тонкий отдел кишечника, оболочка «наноконтейнеров» вскрывается, и их содержимое выходит в полость кишечника, изменяя его микробиоценоз.

Результаты третьего научно-производственного эксперимента показали, что у свиней, получавших нанокапсулированный препарат «ВетСел», были больше среднесуточные приросты массы тела в среднем по сравнению с контролем на 60-65 г. Препарат обладал выраженным биологическим действием. После его скармливания у свиней 6-месячного возраста повышалось содержание в крови гемоглобина (111,0 ± 1,97 г/л), общего белка (65,5 ± 5,59 г/л), альбуминов (43,0 ± 0,31%). У животных 2 опытной группы содержание этих компонентов крови было меньше и соответственно составляло - 105,5 ± 2,13 г/л; 63,3 ± 0,82 г/л; 42,0 ± 0,46 %; а у свиней 3 контрольной группы - 98,5 ± 0,84 г/л; 62,9 ± 0,96 г/л; 40,5 ± 0,56%.

Положительной особенностью являлось относительно высокое содержание в крови свиней 1 опытной группы гамма-глобулинов (21,8 ± 0,40%) по сравнению с контрольными животными (18,0 ± 0,21%), что, в определённой степени, указывает на более высокую неспецифическую резистентность их организма.

Более низкое содержание в крови свиней, получавших препарат «ВетСел», малонового диальдегида (1,44±0,04-1,56±0,06 мкмоль/л) и, наоборот, высокое содержание витаминов А (0,88±0,04-0,97±0,04 мкмоль/л), Е (7,8±0,10-9,4±0,23 мкмоль/л) и С (17,6±0,41-18,3±0,32 мкмоль/л) по сравнению со свиньями контрольной группы (1,8±0,02-1,92±0,05 мкмоль/л; 0,76±0,04-0,08±0,04 мкмоль/л; 7,2±0,24-7,3±0,12 мкмоль/л; 15,4±0,30-16,1±0,30 мкмоль/л) свидетельствует об антиоксидантных свойствах препарата.

Из других особенностей проведённого нами биохимического анализа крови следует остановиться на результатах исследования селена, содержание которого в крови свиней опытных групп в среднем на 2,4-3,0 мкг/100 мл было больше, чем у контрольных животных. Также отмечено, что у свиней, получавших препараты, ферментативная активность АЛТ (0,62±0,04- 0,66±0,02 ммоль/ч*л) и ACT(0,65±0,02-0,77±0,02 ммоль/ч*л) была несколько выше, чем в контроле (0,62±0,03- 0,71±0,04 ммоль/ч*л), однако эти данные являлись статистически недостоверными (Р>0,05) и не выходили за границы физиологических норм. Это свидетельствует о том, что используемые препараты не оказывали повышенной «нагрузки» на печень.

Более высокое содержание глюкозы в крови свиней опытных групп (2,93±0,053,05±0,02 ммоль/л), чем у контрольных животных (2,70±0,02-2,85±0,05 ммоль/л), связано с обеспечением интенсивного обмена веществ энергетическим материалом у свиней, получавших препараты.

В то же время, при исследовании общего кальция и неорганического фосфора нами не было выявлено достоверных различий (Р>0,05) их содержания в крови опытных (Са-2,63 ± 0,04-2,71 ± 0,04 ммоль/л; Р-1,58 ± 0,02-1,63 ± 0,04 ммоль/л) и контрольных (Са-2,70 ± 0,05-2,74 ± 0,05 ммоль/л; Р-1,51 ± 0,02-1,60 ± 0,02 ммоль/л) животных.

Результаты исследования белкового азота в органах и тканях подопытных свиней представлены в таблице 1, из которой следует, что его содержание было больше у животных, получавших препарат «ВетСел», чем у свиней 2 и 3 групп. При этом по сравнению с контролем полученные данные были статистически достоверными (Р<0,05).

Таблица 1 - Содержание белкового азота в крови и органах подопытных свиней, г%

Группа	Кровь	Стенка тонкого отдела кишечника	Длиннейшая мышца спины	Печень
1 (опытная)	1,88±0,02*	2,48±0,03*	2,69±0,03*	2,71±0,03*
2 (опытная)	1,79±0,01*	2,40±0,02*	2,58±0,04*	2,68±0,04
3(контрольная)	1,45±0,02	2,08±0,06	2,42±0,04	2,57±0,04

-при Р<0,05 по сравнению с контролем.

Более высокое содержание белкового азота в крови и органах свиней, получавших препараты, по-видимому, связано с высоким уровнем метаболизма как местного направления - в кишечнике, так и общего - во всём организме под действием пробиотической микрофлоры и селена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведённых нами исследований указывают на то, что нанокапсулированный препарат «ВетСел» обладает выраженной устойчивостью к кислой среде желудка. Нанокапсулы предотвращают разрушение пробиотических бактерий и позволяют доставлять их в конечную точку назначения - кишечник.

Препарат «ВетСел» можно рекомендовать к использованию как при выращивании свиней, так и других видов домашних животных.