Особенности фосфолипидного состава мембран эритроцитов в условиях постинфарктного кардиосклероза

В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что свободнорадикальное окисление липидов вносит весомый вклад в патогенез ишемического и реперфузионного повреждения миокарда [5, 13, 14]. Интенсификация процессов пероксидации липидов сопровождается зна- чительным изменением состава и степени окисленности мембранных фосфолипидов [14], что способствует снижению активности фосфолипидзависимых энзиматических систем, а в конечном итоге приводит к нарушению целостности липидного бислоя клеточных мембран. В условиях активного течения свободнорадикальных процессов наиболее резко уменьшается количество фосфо- липидов (ФЛ), имеющих в своем составе полиненасыщен-ные жирные кислоты – фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатидилэтаноламин [2, 9]. Избирательная делипидизация мембран вызывает рост отношения холестерол / ФЛ, изменение физико-химических свойств мембран и увеличение их микровязкости. При ишемическом поражении миокарда подобные изменения в мембранах кардиомиоцитов приводят к нарушению их функциональной активности и в крайнем своем проявлении вызывают некроз клеток сердечной мышцы. По этой причине при тромболизисной терапии инфаркта миокарда, а также при проведении операций аортокоронарного шунтирования целесообразно использовать препараты, способные защитить клетки сердечной мышцы, оказывая цитопротекторное и антиоксидантное действие [1, 15]. Показано, что в постинфарктном периоде перекисное поражение клеточных мембран не ограничивается только зоной некроза, а оказывает негативное влияние и на непораженные участки сердца [14]. Индукция перекисного окисления липидов может происходить также в мембранах форменных элементов крови, при вступлении в тесный контакт с пораженным участком миокарда или взаимодействии с его метаболитами [16]. Изменения в биомембранах эритроцитов ведут к снижению деформируемости клеток, гемолизу эритроцитов, увеличению вязкости крови и ухудшению кислородтранспортной функции [9]. Возможно, что такое влияние может являться патогенетически значимым фактором постинфарктного ремоделирования миокарда, приводящего к развитию сердечной недостаточности и нарушению сердечного ритма.

Цель настоящего исследования: изучить фосфолипидный состав мембран эритроцитов крыс и интенсивность процессов перекисного окисления липидов при формировании экспериментального постинфарктного кардиосклероза.

Материал и методы

Исследования выполнены на 20 крысах-самцах линии Wistar массой 180–200 г. У животных опытной группы моделировали инфаркт миокарда, с этой целью под эфирным наркозом им перевязывали левую переднюю коронарную артерию [19]. Животным контрольной группы выполняли ложную операцию без коронароокклюзии. Все экспериментальные манипуляции выполнялись в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденными Министерством здравоохранения СССР (1977 г.). Через 45 суток животных забивали путем декапитации под легким эфирным наркозом, при этом проводили забор крови в пробирку с гепарином в соотношении 1:10. Мембраны эритроцитов получали, проводя гипоосмотический гемолиз стабилизированной гепарином крови с последующим центрифугированием при 7300 g в течение 15 мин [18]. Полученный осадок мембран трехкратно отмывали 0,9%-м раствором хлористого натрия и осаждали центрифугированием в аналогичных условиях. Фосфолипиды из мембран эритроцитов экстрагировали смесью Фолча [7], для этого к 0,2 мл полученных мембран добавляли 4,5 мл смеси хлороформ:метанол (2:1). Экст- ракт первоначально фильтровали через бумажный фильтр. С целью очищения от нелипидных примесей в каждую пробу добавляли 1/5 часть объема 50 мМ СаСl2. Для разделения фаз пробы центрифугировали 15 мин при 1000 g, затем верхнюю фазу декантировали, а нижнюю количественно переносили в грушевидную колбу для упаривания на роторном испарителе. Полученный экстракт растворяли в 0,1 мл смеси хлороформ:метанол (1:1) и использовали для дальнейших определений. Разделение фосфолипидов на основные классы проводили методом тонкослойной хроматографии [17] в слое силикагеля на пластинах “SORBFIL” (АО “Сорбполимер”, Россия) в системе растворителей хлороформ–метанол–ледяная уксусная кислота–вода (60:25:1:4). Для проявления фосфолипидных фракций пластины опрыскивали 2-процентным спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты [7]. Сканирование пластинок осуществляли в направлении хроматографирования липидных экстрактов с последующей количественной обработкой при помощи 4.0 версии компьютерной программы “Gel-Pro Analyzer”. Нами оценивалось соотношение следующих фосфолипидных фракций: сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол и фосфатиди-лэтаноламин. Идентификацию этих фракций на пластинках проводили с помощью стандартов фирмы “Sigma”.

Для оценки состояния процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в плазме крови животных спектрофотометрически определяли содержание первичных продуктов пероксидации липидов – диеновых конъюгатов (ДК), а также одного из конечных продуктов – малонового диальдегида (МДА). Определение ДК и МДА проводили ранее опубликованными методами [15]. О состоянии антиоксидантной системы клеток судили по активности антиокислительных ферментов каталазы [8] и су-пероксиддисмутазы [4]. Общий белок определяли биуретовым методом [6].

У всех включенных в исследование животных по истечении 45 суток после оперативного вмешательства осуществляли гравиметрический контроль за изменением массы левого желудочка. Также производили оценку объема повреждения миокарда [20].

Статистическую значимость различий полученных результатов оценивали с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Манна– Уитни.

Результаты и обсуждение

Через 6 недель после коронароокклюзии сердца опытных животных в сравнении с контрольными были сильно гипертрофированы и имели выраженную зону сформировавшегося рубца. Среднее значение массы сердца животных, перенесших коронароокклюзию, на 80,3±3,61% (p<0,001) превышало аналогичный показатель в группе ложнооперированных; при этом зона постинфарктного рубца составляла в среднем 11,3±0,36% от массы левого желудочка. В ранее опубликованной работе мы показали, что подобное изменение сердечной мышцы после экспериментальной окклюзии коронарной артерии однозначно свидетельствует о развитии кардио- склероза с характерными гистологическими и функциональными нарушениями [10].

Из представленных в таблице 1 результатов хроматографического анализа липидных экстрактов эритроцитарных мембран видно, что через 6 недель после перевязки коронарной артерии состав фосфолипидных фракций мембран эритроцитов животных опытной группы существенно отличался от группы ложнооперирован-ных. Так, в пробах опытной группы выявлялось статистически значимое, более чем на 40%, уменьшение содержания минорного фосфолипида – фосфатидилинозитола, и, напротив, увеличение на 20% содержания структурного фосфолипида – фосфатидилэтаноламина.

Согласно литературным данным, снижение содержания фосфатидилинозитола в структуре мембран может происходить вследствие его большого расходования в качестве предшественника вторичного мессенджера внутриклеточных процессов – диацилглицерола [2], а также деградации в результате усиления свободнорадикального окисления полиненасыщенных жирных кислот, которыми богат данный фосфолипид [9]. Подобные изменения могут свидетельствовать о снижении адаптационных возможностей как отдельных клеток, так и всего организма в целом [11]. С этих позиций выявленное нами увеличение доли легко окисляемого ненасыщенного фосфа-тидилэтаноламина в опытной группе животных (табл. 1) можно расценивать как результат компенсаторных процессов, происходящих в клеточных мембранах в постинфарктном периоде. Это предположение хорошо согласуется с представленными в литературе данными модельных экспериментов, когда добавление в состав искусственных липидных везикул фосфатидилэтаноламина способствовало восстановлению ионтранспортирующей функции очищенной Са2+-АТФазы [3, 21]. Положительный эффект от включения в состав мембранных везикул фос-фатидилэтаноламина был показан и в отношении активности другого ионтранспортирующего фермента – Na,K-АТФазы [3].

Как было отмечено, уменьшение процентного содержания фосфатидилинозитола может происходить в результате интенсификации ПОЛ [14]. В связи с этим мы оценили содержание продуктов пероксидации липидов и активность ферментативных антиоксидантов в сыворотке крови животных рассматриваемых групп. Результаты этих исследований представлены в таблице 2. Видно, что для животных опытной группы было характерно повышенное по сравнению с группой ложнооперирован-ных животных содержание МДА и ДК. Прирост этих показателей составил 20 и 90% соответственно. Высокое содержание ДК в плазме крови животных, выявленное нами по истечении шести недель после окклюзии коронарной артерии, позволяет предположить, что спровоцированное инфарктом увеличение активности процессов ПОЛ запускает свободнорадикальные реакции непосредственно в липидах плазмы и клеточных элементах крови. Определение активности каталазы и СОД показало снижение этих показателей у животных с постинфарктным кардиосклерозом на 22 и 89% соответственно относительно значений в контрольной группе. Полученные результаты вполне укладываются в представления о том,

Таблица 1

Соотношение исследуемых фракций фосфолипидов (%) в мембранах эритроцитов контрольных крыс и на фоне экспериментального кардиосклероза

Примечание: * – статистически значимые различия с группой ложноопери-рованных животных (* – p<0,05; ** – p<0,01);

n – количество животных в группе.

Таблица 2

Содержание продуктов перекисного окисления липидов и активность антиокислительных ферментов в плазме крови животных исследуемых групп

Примечание: * – статистически значимые различия с группой ложноопери-рованных животных (* – p<0,05; ** – p<0,01);

n – количество животных в группе.

что состояние окислительного стресса сохраняется по прошествии 45 суток после моделирования инфаркта миокарда, поскольку, согласно данным литературы, увеличенное образование активных форм кислорода и перекисей липидов способствует снижению активности антиоксидантных ферментов [12].

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что ремоделирование сердца в процессе формирования постинфарктного кардиосклероза сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов в плазме крови и изменением содержания в мембранах эритроцитов как минорных, метаболически значимых (фосфатидилинозитола), так и фракций структурных фосфолипидов (фосфатидилэтанола-мина). Развитие аналогичных процессов в мембранах кардиомиоцитов будет отражаться на функциональном состоянии клетки, ее энергетическом метаболизме и в итоге служить причиной дальнейшей дегенерации сердечной мышцы.