Особенности функциональной активности клеток крови овец в зонах с различной плотностью загрязнения 137Cs

Введение. Ионизирующее излучение является одним из факторов, активно влияющих на гомеостаз биологических объектов. В некоторых субъектах РФ выделяются территории с напряженной радиационной ситуацией, это определяется размещением радиационно опасных объектов. Красноярский край относится к таким территориям. На большей части Красноярского края радиационная обстановка оценивается как благополучная [1]. На территории края выявлено точечное загрязнение поймы р. Енисей техногенными радионуклидами в результате сброса вод охлаждения проточных реакторов ФГУП «Горно-химический комбинат» (ФГУП ГХК), расположенного в г. Железногорске [2, 3].

Для ФГУП ГХК в 2006 г. установлена зона наблюдения, распространяющаяся на 20 км вокруг предприятия и пойму р. Енисей на 1 000 км вниз по течению от г. Железногорска. В 20 км зоне наблюдения (ЗН) ФГУП «ГХК» находится 12 сельских населённых пунктов и г. Железногорск. На 1 000-км участке по пойме р. Енисей в зоне наблюдения расположены более 30 населённых пунктов. В пойме р. Енисей точечное загрязнение прослеживается от Горнохимического комбината до Карского моря, характеризуется пятнистостью и различным составом радионуклидов [4–7].

Впервые использование хемилюминесцентного метода для оценки физиологического состояния животных применил Я.И. Серкиз [8]. В настоящее время хемилюминесцентные методы широко используются для мониторинга антиоксидантных и прооксидантных свойств биологических систем [9].

Ионизирующее излучение, даже в малых дозах, активно действует на гемопоэтическую ткань, изменяет биохимические показатели крови у сельскохозяйственных животных [10]. Установлено, что процессы генерации активных форм кислорода (АФК) клетками организма являются чувствительными к воздействию даже слабых доз ионизирующего излучения [11, 12]. В связи с ограниченностью данных о механизмах воздействия низкодозовой радиации существуют некоторые препятствия в прогнозировании эффектов, возникающих в организме.

Исследование механизма воздействия малых доз радиации на организм сельскохозяйственных животных является перспективным фундаментальным и прикладным направлением. Высокочувствительные хемилюминесцентные методы адекватно отражают состояние свободнорадикальных процессов [13], что позволяет выявить их незначительные изменения при различных физиологических состояниях. В настоящее время хемилюминесцентные методы широко используются для мониторинга антиоксидантных и прооксидантных свойств биологических систем [13, 14].

Однако работ по оценке изменений хемилюминесцентной кинетики генерации АФК клетками периферической крови овец при действии малых доз радиации, в совокупности с данными радиоэкологического обследования агробиоценозов, до настоящего времени не выполнялось. Результаты работы будут актуальными для регионов РФ с дополнительной техногенной нагрузкой и для стран, территория которых была точечно загрязнена техногенными радионуклидами.

Цель исследований . Выявление степени влияния малых доз облучения на кинетику генерации свободных форм кислорода в периферической крови овец.

Задачи : выделение агробиоценозов на территории Красноярского края с дополнительной техногенной нагрузкой и без нее; определение степени изменения гематологических и иммунобиологических показателей периферической крови овец; исследование уровня и интенсивности продукции АФК в периферической крови овец в условиях агробиоценозов с низкодозовой радиационной нагрузкой.

Материалы и методы исследований . Исследования проводились, согласно регламентирующим документам [15], в период 2016–2018 гг. в условиях агробиоценозов Сухобузимского района Красноярского края в с. Б. Балчуг и п. Миндерла.

Село Большой Балчуг находится на надпойменной террасе правого берега протоки р. Енисей в 6 км от границы санитарно-защитной зоны ФГУП ГХК. На пастбищах этого населенного пункта, расположенных на берегу р. Енисей, определены участки с дополнительной антропогенной нагрузкой, которая обусловлена ранней деятельностью ФГУП ГХК. Поселок Миндерла расположен в 50 км на север от г. Красноярска, этот населенный пункт является контрольным, почвы и вода здесь не имеют дополнительного техногенного и природного радиационного загрязнения.

В период 2016–2018 гг. на территории агробиоценозов были проведены работы по измерению γ-фона, для этого использовался поисковый радиометр СРП-68-01, многофункциональ- ный широкодиапазонный профессиональный дозиметр ДРГ-01Т1. На территории агробиоценозов был произведён отбор проб почвы, в них определялась удельная активность техногенных радионуклидов методом гамма-спектрометрии, в геометрии сосуда Маринели в течение 3600 с на гамма-спектрометрах «МКГБ-01 РАДЕК» и «Гамма-1С».

Для оценки степени гематологических изменений у 30 голов мелкого рогатого скота в 2018 г. во время весеннего и осеннего санитарноветеринарного обследования был произведен отбор проб крови. Определялись следующие гематологические показатели: СОЭ, количество лейкоцитов, эритроцитов. Анализ крови выполнялся по общепринятым методикам [16]. Фагоцитарная активность лейкоцитов крови определялась in vitro с частицами латекса (ФГУП ВНИИСК, С-Петербург) (5×108 част./мл), опсонизированными белками пуловой сыворотки овец, при окраске 0,25%-м генцианвиолетом в 3%-м растворе уксусной кислоты.

Оценку кинетики генерации активных форм кислорода выполняли хемилюминесцентным методом. В качестве ХЛ-зондов использовали люцигенин (Sigma-Aldrich) и люминол (Sigma-Aldrich) [13]. Определялись показатели кинетики ХЛ-реакции: амплитуда максимальной активности (I max , имп/с); время достижения максимума (T max , мин); светосумма (S, имп. за 90 мин); индекс активации (ИА = S акт /S спонт , усл. ед.). Хемилюминесцентный анализ проведен по методу В.М. Земскова с соавторами [17] в модификации Г.В. Макар-ской с соавторами [18]. Кинетика спонтанной и индуцированной (активированной) хемилюминесценции регистрировалась на 36-канальном аппаратурно-программном комплексе «Хемилюмино-метр 3601-ПЭВМ» (СКТБ «Наука» СО РАН). Время записи хемилюминесцентной кривой – 90 мин, температура в регистрационной камере +38 ^оС.

Статистическая обработка цифрового материала проведена методом вариационной статистики с помощью прикладных программ Microsoft Office Excel 2007. Различия параметров ХЛ считали достоверными при Р ≤ 0, 05.

Результаты и их обсуждение . При исследовании почв агробиоценозов с. Б. Балчуг и п. Миндерла получены следующие результаты (табл.1).

Радиационная характеристика целинных почв агробиоценозов

Таблица 1

Показатель	Почвы сенокосных и пастбищных участков населенных пунктов
	с. Б. Балчуг	п. Миндерла
Общая площадь гамма-съемки, га	10	10
Количество точек гамма-съемки	69	58
Диапазон изменчивости гамма-фона, мкГр/ч	0,10–0,34	0,08–0,14
Среднее значение гамма-фона, мкГр/ч	0,18 ± 0,08	0,10 ± 0,08
Количество проб	15	10
Диапазон изменчивости удельной активности 137Cs в почвах, Бк/кг	11,6–326	2,8–38
Среднее значение удельной активности 137Cs в почвах, Бк/кг	166,69 ± 33,09***	13,27 ± 1,30

Примечание . *** Р<0,001.

Установлено, что среднее значение γ-фона в агробиоценозах с. Б. Балчуг значительно выше (установлено с доверительной вероятностью Р<0,001), чем в с. Миндерла. Однако значения мощности дозы внешнего γ-излучения в агробиоценозах в с. Б. Балчуг не превышают значений, регламентированных нормативными документами как федерального, так и регионального уровня [19, 20].

Соответственно региональным нормативам, мощность дозы гамма-фона в условиях агробиоценозов с. Б. Балчуг составляет 0,18 мкГр/ч, что ниже уровня регистрации, установленного региональными нормативами качества окружающей среды. Однако в результате работы выявлено, что удельная активность 137Cs в почвах агробиоценозов с. Б. Балчуг в 12,6 раза (Р<0,001) превышает аналогичный показатель для почв п. Миндерла (см. табл. 1). В условиях агробиоценозов с. Б. Балчуг, согласно региональным нормативам качества окружающей среды в области обеспечения радиационной безопасности, необходимо осуществлять периодический контроль радиационной обстановки [20].

Анализ радиоэкологической обстановки проводился согласно площадной активности. Площадная активность агробиоценозов рассчитывалась по средним значениям удельной активности 137Cs в почвах по формуле

П=2,7⋅10-4 ⋅а⋅d⋅h, где а – удельная активность пробы Бк/кг; d – вес пробы, кг; h – высота слоя отбора пробы, см.

Плотность загрязнения почв агробиоценозов с. Б. Балчуг составила 1,08 Ки/км2, в п. Миндер-ла – 0,09 Ки/км2.

В результате расчета площадной активности установлено, что на территории агробиоценозов с. Б. Балчуг, согласно «Критериям оценки экологической обстановки территорий для выявления зон чрезвычайной экологической ситуации и зон экологического бедствия», ситуация оценивается как удовлетворительная. Согласно региональным нормативам, результаты измерений на тестируемых участках подлежат регистрации и учёту.

Согласно полученным данным, в результате расчета плотности загрязнения была проведена дифференцировка территорий агробиоценозов по радиационной опасности. Почвы агробиоценозов п. Миндерла – территория благополучная; плотность загрязнения почв – 0,09 Ки/км2 (3,33кБк/м2), удельная активность 137Cs – 13,27 Бк/кг. Почва агробиоценозов с. Б. Балчуг: плотность загрязения почв – 1,08 Ки/км2 (39,96 кБк/м2), удельная активность 137Cs – 166,69 Бк/кг, результаты исследований подлежат регистрации и учёту.

В результате гематологического анализа установлено, что показатели эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина и СОЭ у животных с территории разной радиационной опасности находятся в одном диапазоне изменчивости и статистически не отличаются (табл. 2).

Гематологические показатели крупного рогатого скота

Таблица 2

Показатель	Плотность загрязнения, Ки/км2
	0,09	1,08
Лейкоциты, ×109/л	6,78 ± 0,48	7,69 ± 0,65
Эритроциты, ×1012 /л	9,44 ± 0,61	7,48 ± 0,83
СОЭ,мм/ч	0,45 ± 0,08	0,79 ± 0,16
Гемоглобин, г %	7,57 ± 0,96	7,11 ± 0,35

Иммунологическим методом выявлено, что фагоцитарная активность лейкоцитов крови овец, содержащихся на территории с плотностью загрязнения 1,08 Ки/км2, значительно ниже (P < 0,01), чем животных с территории с плотностью загрязнения 0,09 Ки/км2 (рис.1).

Хемилюминесцентным методом была определена кинетика спонтанной и антигенактивиро-ванной in vitro генерации АФК клетками периферической крови овец (рис. 2).

0,09

1,08

Плотность загрязнения Ки/км 2

Рис. 1. Фагоцитарный индекс лейкоцитов овец в агробиоценозах с различной радиационной напряженностью

А                                     Б

Рис. 2. Хемилюминесцентная кинетика генерации первичных (люцигенинзависимых) (А) и вторичных (люминолзависимых) (Б) АФК клетками крови овец при антигенной активации in vitro (актив.) и без нее (спонт.) из районов с разным уровнем радиационного загрязнения. По оси абсцисс – продолжительность регистрации, в мин, по оси ординат – интенсивность генерации АФК (I), имп/с

Время образования пиков первичных свободных радикалов у овец, находящихся под воздействием малых доз радиации 1,08 Ки/км2 и обитающих при действии фоновых значений 0,09 Ки/км2 γ-излучающих нуклидов, достоверно не отличается. У всех животных максимальная интенсивность пика спонтанной продукции лю-цигенин-зависимых радикалов находилась в одном диапазоне изменчивости и в среднем была зарегистрирована на 29 мин. При активации фагоцитоза частицами латекса в присутствии люцигенина выход хемилюминесцентной кривой на максимум регистрировался в среднем к 28 мин у всех животных, независимо от плотности загрязнения территории. Антигенная активация in vitro частицами латекса потенцирует активацию прооксидантных реакций. Увеличение количества АФК является доказательством реактивности клеток крови животных и способности организма отвечать на антигенную атаку.

Пик спонтанной активности генерации вторичных АФК у животных с территории с плотно- стью загрязнения 0,09 Ки/км2 регистрировался на 29-й минуте (28,77 ± 2,9). У овец, обитающих на территории с радиационной нагрузкой (1,08 Ки/км2), вторичные радикалы образуются достоверно (Р< 0,01) быстрее на 9 мин, Т max приходилось в среднем на 20 мин (19,89±1,3). При активации клеток крови частицами латекса в присутствии люминола самый быстрый выход хемилюминесцентной кривой на максимум (24,22±2,5 мин) наблюдался у овец, обитающих на территории с техногенной нагрузкой. У овец с территории с плотностью загрязнения 0,09 Ки/км2 антигенактивированный респираторный взрыв достигал своего максимума достоверно (P < 0,001) позже на 20,6±2,04 мин.

Амплитуда максимума (I max , имп/с) спонтанной и активированной генерации первичных радикалов в крови у животных, обитающих на территории с плотностью загрязнения 1,08 Ки/км², была достоверно (Р < 0,05) выше, чем у животных с «чистой» территории (рис. 3).

Рис. 3. Значения параметра I max люцигенин (А) и люминол (Б) усиленной хемилюминесцентной кинетики генерации АФК клетками крови овец на территориях с различным уровнем радиационного загрязнения

При активации фагоцитоза частицами латекса амплитуда максимума у животных, обитающих на территории с плотностью загрязнения 0,09 Ки/км2, не изменяется. При введении частиц латекса в периферическую кровь овец с территории с плотностью загрязнения 1,08 Ки/км2 выявлена тенденция к увеличению амплитуды максимума образования первичных радикалов. Амплитуда максимума активности (Imax, имп./с) спонтанной генерации вторичных радикалов у животных, находящихся на чистой территории, не отличалась от данных с «грязной» территории. Активация клеток крови частицами латекса приводит к увеличению генерации АФК вторичных радикалов (рис. 3, Б). У животных, находящихся на территории с плотностью загрязнения 1,08 Ки/км2, наблюдается достоверное (Р<0,05) увеличение амплитуды максимума генерации при введении частиц латекса in vitro в периферическую кровь.

Суммарное количество первичных радикалов, спонтанно генерирующихся за время регистрации в образце крови овец, находящихся на территории с плотностью загрязнения 1,08 Ки/км2, достоверно (Р<0,05) выше, чем у животных с территории с плотностью загрязнения 0,09 Ки/км2 (рис. 4). При введении частиц латекса увеличивается суммарная продукция АФК в крови у всех животных.

Плотность загрязнения, Ки/км2                               Плотность загрязнения, Ки/км2

А

Б

Рис. 4. Значения светосуммы люцигенин (А) и люминол (Б) усиленной хемилюминесценции при спонтанной и антигенактивированной in vitro продукции АФК клетками крови овец на территориях с различным уровнем радиационного загрязнения

Суммарное количество вторичных АФК, генерирующихся спонтанно в крови овец, обитающих на территории с плотностью загрязнения 1,08 и 0,09 Ки/км2, находится в одном диапазоне изменчивости и статистически не отличается (рис. 5). При активации фагоцитарного процесса in vitro введением частиц латекса дос- товерно (Р<0,05) увеличивается суммарная продукция АФК в крови у всех животных.

На основании полученных данных был рассчитан индекс активации (ИА), который отражает способность клеток крови (нейтрофилов, моноцитов) к генерации АФК в ответ на антигенную стимуляцию in vitro (рис. 5).

□ люци гении

Рис. 5. Значение индекса активации генерации АФК клеток периферической крови овец, обитающих на территориях с различным уровнем радиационного загрязнения

Индекс активации генерации и люминол и люцигенин зависимых АФК у овец, обитающих на территории с различной плотностью загрязнения, находится в одном диапазоне изменчивости и статистически не отличается. Это указывает на одинаковые резервные возможности нейтрофилов к генерации АФК. У овец на территории с плотностью загрязнения 1,08 Ки/км2 выявлена легкая тенденция к увеличению индекса активации продукции первичных и вторичных радикалов.

Выводы . В результате работы установлено, что удельная активность ¹³⁷Cs в почвах агробиоценозов с. Б. Балчуг значительно превышает аналогичный показатель для почв п. Мин-дерла, причиной этого является деятельность ФГУП ГХК. Согласно региональным нормативам качества окружающей среды в области обеспечения радиационной безопасности «Допустимые уровни радиационного загрязнения окружающей среды», на территории сенокоснопастбищных участков с. Б. Балчуг необходимо осуществлять периодический контроль радиационной обстановки.

В результате исследований определено, что у овец, содержащихся на территории с плотностью загрязнения 0,09 и 1,08 Ки/км2, статистически не отличаются:

• •    гематологические показатели, что свидетельствует о соматическом здоровье животных и достаточной степени адаптации организма;

• •    суммарное количество спонтанных вторичных радикалов, при этом время спонтанного и активированного образования пиков первичных свободных радикалов и спонтанной генерации вторичных радикалов приходится на 28 мин;

• •    индекс активации генерации люминол, люцигенин зависимых АФК.

Однако у животных с территории с плотностью загрязнения 1,08 Ки/км2 выявлена легкая тенденция к увеличению индекса активации продукции первичных и вторичных радикалов.

В периферической крови овец, содержащихся на территории с плотностью загрязнения 1,08 Ки/км2, выявлено:

• •    снижение фагоцитарной активности лейкоцитов;

• •    ускорение процесса антигенактивирован-ного образования вторичных радикалов;

• •    увеличение амплитуды максимума спонтанной и активированной генерации первичных радикалов;

• •    увеличение суммарного количества продукции первичных радикалов.