Особенности иммунного ответа у больных генитальным эндометриозом

• ¹Вв едение. Несмотря на совершенствование в течение последнего десятилетия методов диагностики и лечения наружного генитального эндометриоза (НГЭ), это заболевание остается одной из самых частых патологий у женщин репродуктивного возраста [1]. Вопрос об этиологии и патогенезе эндометриоза, несмотря на большое число концепций, в которых делается попытка дать объяснение причинам и механизмам данного заболевания, остается открытым. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о существенной роли в патогенезе эндометриоза нарушений иммунного гомеостаза. У пациенток с эндометриозом выявляются значительные изменения как на системном (увеличение содержания Т-, естественных киллеров (ЕК-лимфоцитов) в периферической крови), так и на локальном (возрастание количества лимфоцитов, нарушение функциональной активности ЕК-клеток в перитонеальной жидкости) уровне [2]. При этом большинство авторов рассматривают смешанную группу больных эндометриозом, куда входят пациентки со всеми стадиями заболевания.

Известно, что эндометриоз относится к опухолевидным процессам дисгормональной природы, а главная роль в удалении из организма чужеродных эндогенных клеток принадлежит триаде: макрофаги — ЕК-клетки — антигенспецифические цитотоксические Т-лимфоциты [3]. Изучению функциональной активности ЕK-клеток у пациенток с эндометриозом посвящено достаточно много работ, но вопрос о том, являются ли связанные с эндометриозом изменения в активности ЕK-клеток причиной или следствием заболевания, все еще остается открытым. Кроме того, согласно результатам ряда исследований, в развитии эндометриоза могут быть вовлечены оба звена иммунной системы: клеточный иммунитет, в котором определенные свободные клетки борются с болезнью, и гуморальный, где антитела сформированы, чтобы напасть на антигены [4].

Комплекс иммунных факторов представляет собой систему, участвующую в интеграции организма как единого целого, обновлении, росте и развитии клеток, тканей, органов, защите организма от повреждающих факторов в процессе жизнедеятельности в норме и при патологии [3]. Из иммунных компонентов наиболее изучены субпопуляции лимфоцитов и циркулирующие антитела, но тем не менее при изучении фенотипического профиля лимфоцитов в крови больных НГЭ получены противоречивые результаты [5, 6].

Исходя из изложенного, целью настоящего исследования явилось изучение иммунного ответа у больных с наружным генитальным эндометриозом.

Методы. Обследовано 126 пациенток с НГЭ в возрасте от 22 до 44 лет. Средний возраст больных составил 28,5±5,7 года. Поражение яичников отмечено у 50,8% больных, труб — у 17,4%, влагалища — у 16,7% и шейки матки — у 15,1%. I степень распространения НГЭ обнаружена у 38, II степень у 35, III степень у 31 и IV степень у 22 больных. Эндометриозу сопутствовало бесплодие с превалированием первичного бесплодия (40 больных): соотношение первичного и вторичного бесплодия составило 1,8:1 (55,5 и 44,4% соответственно). Аборты имелись в анамнезе у 70 (55,5%) обследованных женщин. У 20 обследованных НГЭ протекал бессимптомно, у остальных 106 отмечались боли и кровянистые выделения. Наиболее часто больные предъявляли жалобы на ноющую боль внизу живота (75,4%), а также боль в области поясницы (36,8%). Выявлено сочетание НГЭ со спаечным процессом у 81 (64,3%) пациенток, с воспалительными заболеваниями придатков у 73 (57,9%) и с циститом у 37 (29,4%) больных. Контрольную группу составили 16 женщин с нормальной репродуктивной функцией.

Иммунологический статус оценивали путем определения показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета. При этом использовали иммунологические тесты 2-го уровня: фенотипирование лейкоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD19+, CD25+), исследование иммуноглобулинов класса А, М, G и ЦИК.

Исследование содержания иммунных компонентов проводили в периферической крови (ПК) и перитонеальной жидкости (ПЖ), взятой во время лапароскопии. Выделение лейкоцитов из периферической крови и ПЖ проводили методом градиентного центрифугирования с помощью среды «Ficoll-Paque» плотностью 1,114 и 1,07. Субпопуляционный состав лейкоцитов ПК и ПЖ определяли методом проточной цитофлоуриметрии моноклональными антителами фирмы «Сорбент» (Россия) на цитофлоуриметре «Coulter Epix XL» фирмы «Beckman Coulter» (США). Иммуноглобулины: IgA, IgM и IgG определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (1965). Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) определяли путем осаждения их из сыворотки 3,5% полиэтиленгликолем (м.м.6000) фирмы «Serva».

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи пакета статистической программы «Statgraphics» фирмы STSC (США). При этом соблюдались общие рекомендации для медицинских и биологических исследований [7]. Достоверность различий оценивалась с помощью вычисления непараметрического критерия Вилкоксона — Манна — Уитни. Вычислены средние значения полученных выборок (M), стандартные ошибки (m), минимальные (min), максимальные (max) значения рядов. Для предварительной оценки разницы между вари- ационными рядами использовался параметрический критерий t Стьюдента. Далее для сравнения и определения достоверности количественных различий в группах и подгруппах использовался непараметрический ранговый U-критерий Уилкоксона.

Результаты. Клеточный состав иммунитета женщин с различной степенью НГЭ оценивали на основании определения мембранных маркеров. Полученные результаты исследования показали, что разницы в показателях у больных с I и II степенью практически не выявлялось, так же как и у больных с III и IV степенью заболевания. Учитывая это, пациентки были разделены на две группы: в I группу вошли 73 женщины с I и II степенью распространенности эндометриоза, во II группу 53 женщины с III и IV степенью распространенности.

Наиболее заметные изменения были в содержании Т-лимфоцитов и ЕК-клетках. У больных НГЭ достоверно снижается количество Т-лимфоцитов (CD3+), а также отмечается выраженное повышение процентного содержания ЕК-клеток (CD16+). При этом у больных II группы, т.е. с III и IV степенью НГЭ, выявлено более значительное изменение этих показателей. Так, у пациенток I группы уровень CD3+ в сравнении с контрольными показателями был снижен на 6,8%, у больных II группы на 13,3%. При сравнении величин CD16+ у больных I и II групп разница с контрольными значениями в среднем составила 14,9 и 52,8% соответственно. В I и II группе были такие больные, у которых уровень натуральных киллеров был ниже, чем в контроле. В частности, у семи больных с малыми формами НГЭ количество CD16+ составило 14,2% (контроль 14,8%), а у 6 больных II группы 14,1 %.

НГЭ характеризовался сниженным количеством CD4+ и CD8+ субпопуляций, Однако это снижение в обследованных группах несколько различалось. У больных с I–II степенью НГЭ разница относительного содержания хелперов с контролем была не столь значительной и составила 3,8%, у больных с III-IV степенью содержание этих клеток было меньше контрольных на 9,4%, т.е. снижение уровня CD4+ коррелировало со степенью заболевания. Коэффициент корреляции был соответственно r=0,341 и r=0,405. Относительное количество супрессоров (CD8+) у женщин с I–II степенью НГЭ составило в среднем 20,1%, что на 9,5% ниже, чем в контрольной группе, у женщин с III-IV степенью заболевания — 21,3%; как видно, разница с нормальными величинами была незначительной — 4,1 %. Изменения в клеточном звене иммунитета у женщин с малыми формами эндометриоза выражались в снижении содержания клеток CD8+ фенотипа. У этих больных отмечались самые низкие значения — 19,0-19,2%. Положительная корреляция выявлена также между изменением количества CD3+ и распространенностью НГЭ: чем выше степень эндометриоза, тем ниже уровень Т-лимфоцитов (r=–0,385).

Известно, что величина индекса иммунорегуляции (CD4+ / CD8+) является важным показателем гармоничной функции иммунной системы. У больных НГЭ I–II стадии отмечается тенденция к увеличению этого показателя, по-видимому, за счет снижения содержания клеток CD8+.. Снижение этого показателя наблюдалось в обеих группах, но более значительным оно было у пациенток I группы. Выявлено снижение активированных Т- и В клеток (CD25+) у пациенток обеих групп: в I группе на 9,7%, во II группе на 19,9%.

В целом у больных I группы отмечалась тенденция к снижению количества CD19+ клеток, но у больных с распространенными формами (II группа) содержание этих клеток достоверно увеличивалось и в среднем на 27,8% превышало таковые в контроле.

При сравнении содержания лимфоцитов в ПЖ пациенток II группы и здоровых женщин не выявлено различий в относительном количестве ЕК-лимфоцитов (CD16⁺), тогда как обнаружено значительное увеличение как общего количества Т-лимфоцитов, оцениваемого по содержанию клеток CD3⁺, так и повышение содержания клеток регуляторных субпопуляций — хелперов / индукторов (CD4⁺) и супрессоров / цитотоксинов (CD8⁺) (табл. 1 ) .

Как следует из табл. 1, различия в содержании общих Т-лимфоцитов оказались статистически достоверными при сравнении с результатами анализа в обеих группах. При этом в I группе исследования не отмечено заметных изменений содержания субпопуляций CD4⁺ и CD8⁺, за исключением ЕК-клеток. Уровень естественных киллеров превышал контрольные показатели на 55,5%. У женщин с III-IV степенью НГЭ наряду с повышением CD3⁺ лимфоцитов выявлен рост уровня CD4 + на 36,4%, CD8 + — на 19,4%. Изменение уровня CD19⁺ лимфоцитов носило такой же характер, как и в ПК. У женщин I группы содержание этих субпопуляций несколько снижалось (на 25,0%), у больных II группы, напротив, количество В-клеток повышалось в 2,1 раза (p<0,05). Выявлено снижение CD25⁺ в ПЖ при НГЭ в сравнении с контрольными показателями на 23,3% в обеих группах. При этом снижение не коррелировало со степенью эндометриоза.

Таблица 1

Относительное содержание (в %) основных клеточных популяций в ПЖ больных НГЭ разной степени и контрольной группы

Кластер дифференцировки (CD)	Контрольная группа (n=16)	Больные НГЭ (n=126)
		I группа (I IIстепени) (n=73)	II (III-IV степени) (n=53)
CD3+	49,2 (45,3-53,6)	58,0* (56,0-60,2)	64,5* (61,7-67,4)
CD4+	21,4 (19,0-23,9)	22,0 (20,2-23,7)	29,2* (27,1-31,4)
CD8+	32,4 (30,7-34,6)	31,4 (29,0-33,2)	38,7 (35,4-42,2)
CD4+/CD8+	0,66 (0,62-0,69)	0,70 (069-0,71)	0,75* (0,74-0,76)
CD16+	8,1 (6,6-9,8)	12,6 (7,6-15,7)	8,0 (6,7-10,0)
CD19+	1,2 (0,8-1,6)	0,9 (0,5-1,3)	2,5* (1,9-2,6)
CD25+	3,0 (2,9-3,1)	2,3* (2,1-2,6)	2,3* (2,0-2,5)

П р и м еч а н и е : * – статистически достоверно с контрольными показателями (р<0,05).

В ходе исследования выявлены изменения и в гуморальном звене иммунитета больных НГЭ. В частности, средний уровень ЦИК у больных обеих групп достоверно превышал контрольные величины. Кроме того, у больных НГЭ выявлено повышение содержания в сыворотке крови IgA и IgG на фоне нормального уровня IgM. У больных I группы содержание IgA превышало контроль в среднем на 3,8%, IgG — на 5,6%, у пациенток II группы — на 7,1 и 7,4% соответственно. Эти показатели позитивно коррелировали с распространенностью НГЭ (r=0,282). Положительно коррелировали со степенью заболевания и ЦИК. Так, у больных с I–II степенью НГЭ их количество в крови было выше на 19,4% (p<0,05, r=0,259), у больных с III-IV степенью заболевания — на 28,3% (p<0,05, r=0,381). При этом отмечались изменения этих же показателей в ПЖ.

Изменение показателей гуморального звена в ПЖ в основном носило такой же характер, как и в ПК. Содержание ЦИК увеличивалось, коррелируя со степенью заболевания, в частности у больных с I–II степенью уровень ЦИК в ПЖ был выше контрольных на 27,5%, у пациенток с III-IV степенью на 32,2%. Отмечалось также достоверное увеличение IgA в обеих группах на 8,8 и 10,4% соответственно. Содержание IgG у больных II группы превысило контрольные значения на 17,5%, у больных I группы — на 9,5%. Уровень IgM, так же как в ПК, находился в пределах нормы.

Изменения показателей иммунитета у женщин с воспалительными заболеваниями проявлялись более выраженно. Следует отметить у таких больных достоверное снижение CD3+ и повышение ЦИК в обеих биологических жидкостях, т.е. в ПК и ПЖ.

При сравнении содержания компонентов иммунитета в крови и перитонеальной жидкости выявленные изменения носили не однонаправленный характер (табл. 2). Как видим, различий в сдвигах показателей гуморального иммунитета в ПК и ПЖ не отмечалось. В то же время на фоне одинакового изменения ЦИК и иммуноглобулинов показатели клеточного звена в ПК и в ПЖ изменялись диаметрально противоположно, особенно это касалось субпопуляций CD3+, CD4+ и CD8+.

Таблица 2

Сравнительная характеристика компонентов иммунитета у больных НГЭ в периферической крови и перитонеальной жидкости

Показатель	Больные НГЭ (n=126)
	ПК	ПЖ
CD3+
CD4+
CD8+ CD4+ / CD8+		N,
CD16+		, N
CD19+
CD25+ ЦИК IgA
IgM IgG	N	N

При фенотипировании лимфоцитов ПК пациенток с разной степенью эндометриоза выявлены следующие нарушения иммунитета в группах: при малых формах содержание супрессорно-цитотоксической субпопуляции Т-клеток (CD8+) изменялось в сторону снижения, вследствие чего имело место увеличение иммунорегуляторного индекса CD4+ / CD8+; кроме того, отмечалось увеличение процента CD16+ клеток. При III–IV степени эндометриоза были обнаружены другие изменения: повышение содержания В-клеток и CD16+ лимфоцитов. Увеличение содержания CD16+-клеток, ответственных за уничтожение попавших в перитонеальную полость путем ретроградного заброса менструальной крови, может быть немаловажным фактором при данном заболевании. В то же время D. J. Oosterlynk и соавт. [2] отмечают уменьшенную деятельность киллерных клеток, которые тем самым вносят свой вклад в сокращение клеточной неприкосновенности. Уменьшение относительного количества клеток фенотипа CD3+, зафиксированное при НГЭ и особенно в группе женщин с III–IV степенью эндометриоза, по-видимому, происходит вследствие снижения содержания обеих (CD4+ и CD8+) иммунорегуляторных субпопуляций, поэтому иммунорегуляторный индекс в их ПК не изменялся (1,68, контроль-1,67). Таким образом, результаты фе-нотипирования лимфоцитов ПК подтвердили ранее выявленные нарушения клеточного звена иммунитета у больных эндометриозом [2], которые различны по проявлениям у женщин с разной степенью заболевания.

Наряду с изменениями клеточного иммунитета у больных НГЭ в ПК отмечалось повышение уровня IgG и IgA. Иммуноглобулины класса G обеспечивают противоинфекционную защиту, IgA нейтрализуют токсины и вызывают агглютинацию микроорганизмов и вирусов.

Обсуждение. Недостаточность клеточного иммунитета является важным этиологическим фактором развития эндометриоза. При НГЭ активируются CD16⁺ клетки, именно они способны выделять факторы, стимулирующие имплантацию и пролиферацию жизнеспособных фрагментов эндометрия, поддерживая тем самым развитие эндометриоза. В то же время клеточный иммунитет зависит от действия гуморальных факторов, выделяемых цитотоксическими лимфоцитами (Т-киллерами).

На современном этапе представляет интерес концепция, выдвинутая W. P. Dmowski и соавт. [4] и R. W. Shaw [8], согласно которой ретроградное перемещение эндометриоидных фрагментов при менструации бывает у всех женщин, отторжение или имплантация этих фрагментов зависит от функции иммунной системы, эндометриоз отражает недостаточность иммунной системы, которая передается по наследству, иммунная недостаточность может быть как качественной, так и количественной, приводящей к эндометриозу; выработка аутоантител — это реакция на эктопический эндометрий; и она, в свою очередь, может способствовать бесплодию при эндометриозе.

Данная гипотеза в сущности представляет комбинацию имплантационной и иммунологической теорий. Авторы этой концепции утверждает, что эндометриоидные фрагменты перемещаются через маточные трубы у всех женщин. В брюшной полости они перераспределяются иммунной системой, представленной главным образом перитонеальными макрофагами.

Проведенное исследование свидетельствует, что клиническому проявлению эндометриоза в 29,8% случаев предшествовали инфекция, передающаяся половым путем, и нарушения влагалищного биоценоза, что указывает на их возможную роль в патогенезе заболевания.

Как и предполагалось, значительно более выраженные изменения в функционировании иммунной системы обнаруживались на локальном уровне, в непосредственной близости от имплантатов — в ПЖ. Последняя, представляющая микроокружение очагов эндометриоза, содержит как множество растворимых факторов, влияющих на процесс имплантации и роста эндометриоидных эктопий, так и большое количество клеточных элементов, продуцирующих эти факторы [3].

В-клетки представлены в ПЖ как больных эндометриозом, так и здоровых женщин в очень незначительном количестве. Выявленные изменения иммунитета на локальном уровне касались в основном Т-клеточного звена и проявились увеличением общего количества Т-лимфоцитов, содержания клеток хелперной субпопуляции (CD4+) и относительного содержания CD8+ лимфоцитов у больных НГЭ III–IV степени. Иммунорегуляторный индекс также возрастал. Эти результаты подтверждают наличие воспалительного процесса в перитонеальной полости [3]. Увеличение при эндометриозе содержания Т-лимфоцитов, в активированном состоянии вырабатывающих спектр цитокинов и факторов роста, в свою очередь способных усиливать рост эндометриоидных клеток in vitro [9], предполагает нарушения в регуляции иммунного ответа. По-видимому, вслед за активацией иммунных процессов на начальных стадиях заболевания, на более поздних воспалительный процесс, развивающийся в ответ на присутствие эндометриоидной ткани в перитонеальной полости и из-за невозможности удаления очагов эндометриоза, прогрессирует, в результате чего возникают инфильтрация, фиброз и инкапсуляция очагов эндометриоза [10]. Это подтверждается результатами проведенного исследования, в ходе которого были выявлены изменения в Т-клеточном звене иммунитета при III–IV степени эндометриоза.

Заключение. Таким образом, в процессе исследования выявлено, что у больных НГЭ отмечается угнетение клеточного и повышение гуморального звеньев иммунитета, повышение уровня ЦИК. Степень выраженности сдвигов иммунитета была связана с наличием воспалительных заболеваний, длительностью заболевания, локализацией патологического очага. Полученные результаты показали снижение параметров субпопуляций CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺ в ПК и повышение их в ПЖ. Вместе с тем как в ПК, так и в ПЖ у больных с малыми формами НГЭ увеличивалось относительное количество CD16⁺ лимфоцитов, в то время как у пациенток с III–IV степенью заболевания при значительном увеличении этих клеток в ПК отмечалось нормальное их количество в ПЖ.