Особенности иммунной регуляции и генетического полиморфизма у городского населения в условиях экспозиции тяжелыми металлами

2011; Долгих и др., 2014; Tanabe et al., 2015; Зайцева, Долгих, Дианова, 2016].

Металлы относятся к распространенным компонентам химического воздействия, которые обладают способностью оказывать иммунотоксические, канцерогенные и мутагенные эффекты на функции иммунокомпетентных клеток, а также выступать сенсибилизирующими факторами, определяя формирование патологических изменений состояния здоровья и развития иммуноопосредованных аллергических, аутоиммунных или пролиферативных заболеваний [Lehmann, Sack, Lehmann, 2011; Zhu et al., 2014; Старкова и др., 2017].

Цель работы – исследование особенностей показателей иммунной регуляции и генетического полиморфизма у городского населения, проживающего в условиях воздействия тяжелыми металлами.

Материалы и методы исследований

Обследовали взрослое население в возрасте 25– 35 лет, постоянно проживающее в крупном промышленном центре (г. Ачинск Красноярского края) при техногенном загрязнении воздушной среды тяжелыми металлами. Группу наблюдения составили 37 чел., которые постоянно проживают в зоне влияния промышленных объектов, а группу сравнения – 20 чел., жители «условно чистого» района (г. Сосновоборск Красноярского края), Группы были сопоставимы по полу, возрасту и соматической заболеваемости.

Определение массовых концентраций химических элементов в биосредах населения проводили методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой в соответствии с МУК 4.1.3230-14 и МУК 4.1.3161-14, СТО М 25-2017 на масс-спектрометре Agilent 7500 сх (Agilent Technologies Inc., США). Показатели фагоцитоза оценивали с использованием формалинизированных эритроцитов барана, сывороточные иммуноглобулины (IgG, IgM, IgA) исследовали методом радиальной иммунодиффузии по Манчини, специфические антитела к металлам (IgG к алюминию, свинцу, ванадию; IgE к марганцу, хрому) определяли методом аллергосорбентного тестирования с ферментной меткой. Исследование популяций лимфоцитов по мембранным CD-маркерам проводили с использованием панели меченых моноклональных антител к мембранным CD-рецепторам («Becton Dickinson», США) на проточном цитометре FACSCalibur («Becton Dickinson», США) с использованием универсальной программы CellQuest.PrO, суммарно регистрировали не менее 10 000 событий. Цитокиновые медиаторы интерлейкин (IL)-1бета, IL-8 определяли с использованием тест-систем (ЗАО «Вектор-Бест», Россия) методом иммуноферментного анализа на анализаторе «Elx808IU» (США).

Статистический анализ полученных данных проводили в пакете прикладных программ Statistica 6.0 (Statsoft, США) методом вариационной статистики, рассчитывая среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (m). Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента. Модели зависимости «маркер экспозиции – маркер эффекта» выявляли методом корреляционно-регрессионного анализа на основе критерия Фишера и коэффициента детерминации (R2). Различия между группами считали достоверными при р < 0.05.

Генетический анализ проводили на основе биоматериала со слизистой оболочки ротоглотки. Выделяли ДНК сорбентным методом. Для определения генотипов использовали метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на термоциклере CFX96 (Bio-Rad, США), а также метод аллельной дискриминации. Обработку данных проводили с помощью программы «Ген Эксперт» по равновесию Харди-Вайнберга на основе диагностики однонуклеотидных полиморфизмов.

Результаты и их обсуждение

Результаты химико-аналитического исследования показали присутствие контаминантов в крови обследованной группы городского населения с повышенным содержанием алюминия в 100% случаев, марганца в – 13.5% случаев, хрома в – 16.2% случаев, свинца в – 27% относительно фоновых уровней (Пермский край). При этом достоверное возрастание концентрации металлов в моче отмечено относительно показателей группы сравнения, в 2.11 раза по алюминию (группа наблюдения 0.0169±0.0064 мг/дм3, группа сравнения 0.008±0.003 мг/дм3, p < 0.05), в 1.88 раза по ванадию (группа наблюдения 0.0003±0.00004 мкг/см3, группа сравнения 0.00016±0.00006 мкг/см3, p < 0.05), а также в 1.82 раза по марганцу (группа наблюдения 0.00069±0.0003 мкг/см3, группа сравнения 0.00038±0.00009 мкг/см3), не достигшее, однако, уровня достоверности.

Проведенное клинико-лабораторное исследование выявило изменение показателей иммунной регуляции у городского населения группы наблюдения (табл. 1). Так, при сравнительном анализе с референтными уровнями показано соответствие параметров CD-иммунограммы, за исключением достоверно повышенного абсолютного и относительного количества регуляторных CD4+CD25+CD127--лимфоцитов у 68.4–100% обследованного контингента (p < 0.05), а также снижение содержания CD3+CD25+-лимфоцитов у 47.4–57.9% группы наблюдения, различия достоверны по кратностям превышения нормы (p < 0.05). Отмечено возрастание как абсолютного, так и процентного количества CD4+CD25+CD127--лимфоцитов относительно показателей группы сравнения, в сред- нем в 2.62–3.13 раза (p < 0.05).

Таблица 1

Особенности иммунной регуляции у городского населения в условиях экспозиции тяжелыми металлами

Показатель	Референтный интервал	Группа наблюдения	Группа сравнения
CD3+CD4+-лимфоциты, 109/дм3	0.41-1.59	0.964±0.173	0.811±0.183
CD3+CD4+-лимфоциты, %	31-60	48.684±4.046	44.0±6.288
CD3+CD8+-лимфоциты, 109/дм3	0.19-1.14	0.466±0.082	0.545±0.164
CD3+CD8+-лимфоциты, %	13-41	23.842±2.627	28.64±5.920
CD3+CD25+-лимфоциты, 109/дм3	0.19-0.56	0.216±0.063	0.193±0.062
CD3+CD25+-лимфоциты, %	13-24	10.526±3.142	10.46±3.128
CD4+CD25+CD127--лимфоциты, 109/дм3	0.015-0.040	0.075±0.025*/**	0.024±0.009
CD4+CD25+CD127--лимфоциты, %	0.8-1.2	3.599±0.852*/**	1.374±0.619
CD3+CD95+-лимфоциты, 109/дм3	0.63-0.93	0.812±0.113	0.62±0.20
CD3+CD95+-лимфоциты, %	39-49	43.632±6.568	34.18±8.072
Абсолютный фагоцитоз, 109/л	0.964-2.988	1.771±0.281	1.96±0.375
Процент фагоцитоза, %	35-60	39.0±4.257	42.60±5.747
Фагоцитарное число, у.е.	0.8-1.2	0.758±0.131	0.865±0.162
Фагоцитарный индекс, у.е.	1.5-2.0	1.894±0.162	1.995±0.145
IgG, г/л	10-18	12.932±0.747	11.95±0.817
IgM, г/л	1.1-2.5	1.581±0.127*	1.361±0.125
IgА, г/л	1.1-3.0	2.666±0.275*	2.072±0.386
IgE специфический к марганцу, МЕ/мл	0-1.21	0.312±0.068*	0.191±0.041
IgE специфический к хрому, МЕ/мл	0-1.01	0.302±0.082*	0.116±0.039
IgG специфический к алюминию, у.е.	0-0.1	0.222±0.054**	0.163±0.055
IgG специфический к ванадию, у.е.	0-0.38	0.210±0.049	0.208±0.073
IgG специфический к свинцу, у.е.	0-0.1	0.203±0.048**	0.172±0.051
IL-1бета, пг/мл	0-11	2.994±1.822*	0.673±0.263
IL-8, пг/мл	0-10	7.071±1.443*	4.818±1.853

Примечание. * – разница достоверна относительно группы сравнения (p<0.05); ** – разница достоверна относи- тельно референтного интерала (p < 0.05).

Использование математического моделирования и методического приема оценки отношения шансов изменения иммунологических тестов при возрастании концентрации контаминантов в биологических средах показало достоверное повышение количества CD3+CD4+-лимфоцитов при увеличении содержания марганца и хрома в крови (R2 = 0.92–0.94; p < 0.05), CD3+CD8+- и CD3+CD95+-лимфоцитов при увеличении уровня алюминия в моче (R2 = 0.26–0.79; p < 0.05), CD4+CD25+CD127--лимфоцитов при увеличении концентрации хрома в крови (R2 = 0.14; p < 0.05).

Показатели фагоцитарной активности достоверно не отличались от установленной физиологической нормы, однако повышаются шансы возрастания «абсолютного фагоцитоза» и «фагоцитарного индекса» при увеличении содержания марганца в крови и алюминия в моче (R2 = 0.24–0.79; p < 0.05).

Выявлено изменение содержания сывороточных иммуноглобулинов с преимущественным повышением уровня IgА у 36.1% обследованных и снижением IgM у 13.5% группы наблюдения по сравнению с возрастной нормой, различия достоверны по кратностям превышения нормы (p < 0.05).

Кроме того, у обследованного населения показано достоверное повышение продукции IgM и IgA относительно уровней в группе сравнения в 1.16 и 1.29 раза соответственно (p < 0.05). Анализ шансов повышения показателей гуморального иммунитета при изменении содержания контаминантов в биологических средах выявил возрастание концентрации IgG и IgA при увеличении уровня свинца и алюминия в крови (R2 = 0.92–0.94; p < 0.05) и алюминия в моче (R2 = 0.20–0.30; p < 0.05).

Одновременно показано возрастание уровня специфической сенсибилизации по концентрации специфических антител IgG к алюминию и свинцу у 69.4% обследованного контингента при сравнении с референтными значениями (p < 0.05). Также выявлено повышение уровня специфических антител IgE к марганцу и хрому относительно значений группы сравнения в 1.63 и 2.6 раза соответственно (p < 0.05).

Исследование параметров цитокиновой иммунной регуляции не выявило достоверных отклонений от референтного диапазона, при этом показано возрастание содержания провоспалительных факторов IL-1бета и IL-8 в 4.45 и 1.47 раза соответственно относительно группы сравнения (p < 0.05). Увеличиваются шансы повышения концентрации IL-8 при возрастании уровня алюминия в моче (R2 = 0.68; p < 0.05).

Таким образом, выявлены существенные изменения показателей иммунной регуляции у городского населения, проживающего в условиях экспозиции тяжелыми металлами, которые развиваются на фоне негативных тенденций, связанных с особенностями генетического полиморфизма у обследованной группы населения (табл. 2). Так, по генам ферментов детоксикации отмечено повышение частоты мутантных аллелей цитохрома Р-450 CYP1A1 в 1.27 раза и копропорфириноген-оксидазы CPOX в 1.33 раза относительно группы сравнения, определяемое увеличением распространенности гетерозиготного варианта генотипа. Кроме того, показано возрастание частоты минорного генотипа цинк-металлопептидазы ZMP_STE24 в 1.6 раза (8 против 5% в группе

Таблица 2

Особенности генетического полиморфизма с распределением частот генотипов у городского населения, экспонированного тяжелыми металлами

Ген	CYP1A1 (rs1048943)		CPOX (rs1131857)		ZMP_STE24 (rs2076697)		MTHFR (rs1801131)		FOXP3 (rs3761547)		TLR4 (rs1927911)
Ю НН 03 5 к й cd ® И п л	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%
	A/A	43	A/A	57	T/T	84	A/A	41	T/T	84	A/A	51
	A/G	57	A/C	38	T/C	8	A/C	51	T/C	14	A/G	41
	G/G	0	C/C	5	C/C	8	C/C	8	C/C	3	G/G	8
	A	72	А	76	Т	88	А	66	Т	91	A	72
	G	28	С	24	С	12	С	34	С	9	G	28
S м сЗ о cd п	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%	Генотип/ аллель	%
	A/A	55	A/A	70	T/T	85	A/A	55	T/T	90	A/A	70
	A/G	45	A/C	25	T/C	10	A/C	35	T/C	0	A/G	30
	G/G	0	C/C	5	C/C	5	C/C	10	C/C	10	G/G	0
	A	78	А	82	Т	90	А	73	Т	95	A	85
	G	22	С	18	С	10	С	27	С	5	G	15

Результаты опубликованных исследований показывают способность металлов воздействовать на систему иммунной регуляции, определяя как активирующие, так и иммуноингибирующие эффекты на функции иммунокомпетентных клеток и связанных с ними медиаторов [Ohsawa, 2009; Засорин, Курмангалиев, Ермуханова, 2012; McKee, Fontenot, 2016]. В настоящей работе выявлено преимущественно стимулирующее влияние металлов на показатели иммунной реактивности, что может быть связано с мобилизацией регуляторных систем организма, обеспечивающих адаптационный потенциал в условиях дестабилизации среды обитания.

Заключение

Проведенное исследование особенностей показателей иммунной регуляции у городского населения, проживающего на промышленно развитой территории в условиях экспозиции тяжелыми металлами, выявило активацию регуляторных CD4+CD25+CD127--лимфоцитов, повышение продукции сывороточных иммуноглобулинов IgM и IgA, возрастание уровня специфических антител к сравнения). В то же время выявлено изменение соотношения генотипов по генам иммунной регуляции, в частности, повышение частоты мутантного аллеля транскрипционного фактора FOXP3 до 9%, в 1.8 раза относительно группы сравнения, а также вариантного аллеля метилентетрагидрофолат-редуктазы MTHFR на уровне 34 против 27% в группе сравнения, связанные с возрастанием встречаемости, в первую очередь, гетерозиготного генотипа. Отмечено появление минорного вариантного генотипа по гену толл-подобного рецептора TLR4 с частотой 8% в группе наблюдения при его отсутствии в группе сравнения с увеличением распространенности мутантного аллеля в 1.87 раза относительно группы сравнения.

марганцу, хрому, алюминию, свинцу, изменение продукции цитокиновых медиаторов IL-1бета и IL-8. Выявленные изменения иммунной реактивности развиваются на фоне повышения индивидуальной генетической вариабельности у обследованной группы населения с преимущественным повышением частоты минорного аллеля по генам детоксикации и иммунной регуляции CYP1A1, CPOX, FOXP3 и TLR4. Полученные результаты позволяют определить иммунные и генетические маркеры состояния здоровья населения в условиях специфического воздействия среды обитания тяжелыми металлами.