Особенности изменения содержания протеаз и ингибиторов протеаз в хронических гнойных ранах

Актуальность. Помимо клинических признаков инфекции (например, воспаления, гнойности и боли), для определения раневой инфекции исторически использовалось количество микроорганизмов. Однако все чаще признается, что не только высокий уровень бионагрузки вреден для заживления ран, но и вирулентность вторгающегося микроорганизма и иммунный статус хозяина могут повлиять на клинические исходы. Бактерии, такие как синегнойная палочка, золотистый стафилококк и эпидермальный стафилококк, разработали ряд факторов вирулентности, которые помогают им преодолевать защиту хозяина и размножаться в подлежащих мягких тканях. Более конкретно, бактериальные протеазы являются одним из таких факторов вирулентности, которые участвуют в стимулировании инвазии и разрушения ткани хозяина. Из-за сложности микроорганизмов протеазы могут негативно влиять на раневую среду, что приводит к замедленному заживлению ран. Полученные данные свидетельствуют о том, что протеазы могут играть важную роль в раневых инфекциях, способствовать развитию воспалительной реакции и препятствовать заживлению ран [11].

Бактериальные протеазы, способствуют индукции воспалительной реакции у хозяина. Было обнаружено, что протеазы, продуцируемые бактериями, активируют кининовую систему и разлагают кининогены, что впоследствии вызывает воспалительную реакцию в виде отека, покраснения и боли [ 9 ].

Подобно другим иммунологическим факторам, бактериальные протеазы также могут препятствовать фагоцитозу [7], способствуют снижению активности лейкоцитов [6] , ингибированию функции нейтрофилов и препятствию хемотаксиса [8] .

Бактериальные протеазы могут разрушать ряд биологически важных белков-хозяев, таких как компоненты комплемента C3 и C1q [4] , также предотвращать образование C5 путем разрушения C3 [10]. За счет чего нарушается опсонизация и фагоцитоз нейтрофилов, затрудняется или даже предотвращается [15].

Функция бактериальных протеаз в преодолении иммунной системы хозяина заключается в деградации иммуноглобулина хозяина [16] . Это может быть особенно вредным для хозяина, учитывая роль иммуноглобулинов в распознавании и способствовании нейтрализации вторгающихся микроорганизмов. Различные исследователи сообщили о влиянии протеаз на деградацию иммуноглобулинов, в том числе иммуноглобулина A (IgA) и иммуноглобулина G (IgG) [4].

Протеазы и их ингибиторы способствуют балансу между деградацией и отложением внеклеточного матрикса (ВКМ), создавая равновесие, необходимое для своевременного и скоординированного заживления кожных ран. Однако, когда этот баланс нарушается, раны переходят в хроническое состояние, характеризующееся обильным уровнем протеаз и пониженным уровнем ингибиторов протеаз [13].

Соотношения протеаз и их ингибиторов также использовались в качестве прогностических маркеров прогрессирования раны к заживлению. [14].

Многими исследователями подчеркивается ключевая роль протеаз в заживлении ран. Поэтому необходим контроль экспрессии протеаз в раневой среде и способов, которыми чрезмерная экспрессия и активация протеаз может привести к задержке процесса заживления кожных ран. Будущие исследования должны быть нацелены на изучение способов, с помощью которых протеазы могут быть нацелены в качестве альтернативного терапевтического подхода к лечению ран, а также для оценки преимуществ и недостатков использования раневых жидкостей для оценки прогрессирования раны с точки зрения протеолитической активности [13].

Цель исследования: изучить особенности изменения содержания протеаз и ингибиторов протеаз в хронических гнойных ранах.

Материал и методы. В работе были обследованы в первой группе 12 больных с послеоперационными ранами (контроль) и во второй группе 15 больных с гнойными ранами (опыт). У всех больных в диагнозе отсутствовали сердечнососудистые заболевания, диабет и метаболические изменения. Материал для исследования получали путем сбора смывов стерильным физиологическим раствором с поверхности послеоперационных и гнойных ран.

Общую протеолитическую активность в составе смывов определяли казеинолитическим методом по учету продуктов гидролиза казеина в единицах активности (Ед) по тирозину. Ингибиторную (анти-протеолитическую) активность полученных смывов определяли казеинолитическим тестом, по способности убывания активности 0,01% трипсина и 0,01% папаина, при инкубации их с исследуемыми образцами смывов по сравнению с образцами смывов с трипсином или папаином без инкубации. Ингибиторную активность выражали в ингибиторных единицах (ИЕд).

С целью степени выраженности протеолиза в ранах рассчитывался индекс протеолиза - соотношения протеолитической активности к антипротеолитической активности (ОПА/АПА).

Полученные данные подвергались статистической обработке с использованием стандартных программ Microsoft Excel 2007 c вычислением средних величин (М), их ошибок (m), а также коэффициента достоверности разности средних величин Стьюдента-Фишера (t).

Результаты и их обсуждение. Полученные данные показали (Рис.), что у пациентов с послеоперационными ранами средний показатель ОПА в составе смывов составлял 31,7±2,8 Ед/мл. В тоже время у больных с гнойными ранами этот показатель был достоверно выше, по сравнению с аналогичными результатами послеоперационных ран, и составлял 52,4±4,8 Ед/мл (Р<0,01). При этом показатель антипротеолитической активности

• ■ Послеоперационные раны      ■ Гнойные раны

Рисунок.    Изменение показателей общей протеолитической активности (ОПА) и антипротеолитической активности (АПА) смывов послеоперационных и гнойных ран.

• * - достоверно отличающиеся величины относительно показателей ОПА гнойных ран.

о -      достоверно отличающиеся величины относительно соответствующих показателей ОПА послеоперационных ран.

по трипсину в составе смывов послеоперационных ран составлял

28,9±2,5 ИЕд/мл, что было не существенно ниже ОПА в смывах послеоперационных ран, а индекс протеолиза ОПА/АПА по трипсину был также не существенно выше и равен 1,1±0,1. У больных с гнойными ранами показатель антипротеолитической активности по трипсину был достоверно ниже по сравнению с аналогичными результатами больных с послеоперационными ранами и составлял 21,2±1,9 ИЕд/мл (Р<0,05), , а также значительно ниже ОПА смывов гнойных ран. С учетом этих данных индекс протеолиза ОПА/АПА по трипсину находился на уровне 2,5±0,22, что было значительно выше такого же показателя в составе смывов послеоперационных ран. Результат антипротеолитической активности по папаину в составе смывов послеоперационных ран составлял 19,1±1,5 ИЕд/мл, этот показатель был значительно меньше антипротеолитической активности по трипсину, в связи с более низким содержанием ингибиторов протеаз связывающихся с папаином. По этой же причине увеличивался индекс протеолиза ОПА/АПА по папаину и был равен 2,7±0,24. В тоже время у больных с гнойными ранами антипротеолитическая активность по папаину была также значительно ниже антипротеолитической активности по трипсину и составляла 11,6±0,9 ИЕд/мл (Р<0,05), также это проявляется с более низким содержанием ингибиторов протеаз связывающихся с папаином. При этом индекс протеолиза ОПА/АПА при исследовании гнойных ран по папаину был равен 4,5, что было выше индекса протеолиза послеоперационных ран.

Предполагается, что трипсиноподобные сериновые протеазы в раневой среде связываются преимущественно с двумя ингибиторами a1 -ингибитором протеиназ (a1ИП) и a2-макроглобулином (a2М) — принципиально различным образом. Первый полностью инактивирует каталитическую функцию протеаз, а второй лишь ограничивает их способность расщеплять большинство высокомолекулярных субстратов. Кроме того, константа скорости реакции таких протеаз с a2М в 6 раз выше таковой с a1ИП, при этом образуется активный комплекс, способный гидролизовать специфические субстраты, что позволяет большей части поступающих в раневую среду энзимов связываться с a2М. Следует подчеркнуть, что цистеиновые протеиназы (папаин), в отличие от сериновых протеаз, связываются в основном с a2М, а a1ИП не играет существенной роли в блокировании активности протеиназ. Эти данные позволили сделать вывод о том, что сериновые и цистеиновые протеиназы, могу осуществлять свою функцию в связанном с a2М состоянии [1].

Ингибирующая способность трипсина может проявляться существенно за счет низкомолекулярных ингибиторов присутствующих в составе раневого смыва и альфа-1-антитрипсина, а ингибирующая способность папаина за счет высокомолекулярных ингибиторов альфа -1-антитрипсина и альфа 2-макроглобулина. Если учесть, что низкомолекулярным ингибитором, присутствующим в составе раневого смыва может являться секреторный лейкоцитарный ингибитор протеазы, который локально обеспечивает защиту и обладает выраженной противовоспалительной, антибактериальной и противогрибковой активностью. Тогда снижение ингибирующей активности по трипсину в смыве с выраженными проявлениями воспаления можно объяснить, как выраженную провоспалительную и микробную реакцию, проявляющуюся так же увеличением ОПА за счет снижения этого ингибитора. Увеличение ОПА в составе раневых смывов возможно так же связано с увеличением функциональной активности клеток продуцентов протеаз за счет хронического воспалительного процесса [2, 3].

Что касается ингибирующей способности папаина за счет высокомолекулярных ингибиторов в составе раневых смывов, то основными высокомолекулярными ингибиторами папаина могут являться альфа-1-антитрипсин и альфа 2-макроглобулин, которые вырабатываются печенью и осуществляют тормозное действие на протеазы во всех органах и тканях организма [2, 3]. Поэтому снижение ингибирующей способности папаина в составе раневых смывов можно расценивать как проявление системного характера на воспаление или, возможно, на степень хронизации воспалительного процесса.

Исходя из этого, полученные нами данные антипротеолитической активности по папаину и трипсину можно интерпретировать, следующим образом. В послеоперационных ранах, без выраженных проявлений воспаления, имеется равновесие между протеазами и ингибиторами протеаз, которое регулируется в большей степени местными механизмами. В тоже время в хронических гнойных ранах с выраженным воспалительным процессом, нарушено равновесие между протеазами и ингибиторами протеаз, за счет нарушения местных и системных механизмов.

Выводы. В послеоперационных ранах, показатели общей протеолитической активности и антипротеолитической активности существенно не отличаются, имеется равновесие между протеазами и ингибиторами протеаз, которое предположительно может регулироваться местными механизмами. В хронических гнойных ранах общая протеолитическая активность значительно выше этого же показателя послеоперационных ран. При этом антипротеолитическая активность значительно ниже общей протеолитической активности, а также ниже антипротеолитической активности послеоперационных ран, что создает выраженное нарушение равновесия между протеазами и ингибиторами протеаз и способствует хронизации воспалительного процесса в гнойных ранах с подключением, как местных, так и системных механизмов регуляции.