Особенности эндокринного аппарата поджелудочной железы после введения N-ацетилцистеина в модели острого постлучевого панкреатита

Введение. В настоящее время высокая вероятность развития постлучевых состояний обусловлена применением ионизирующего излучения в медицине, а также риском техногенных катастроф. Были разработаны многочисленные нормы (Радиационная защита и безопасность источников излучения: международные основные нормы безопасности МАГАТЭ, 2015) и правила (СанПиН 2.6.1.2523-09 «Нормы радиационной безопасности НРБ-99/2009» от 7.07.2009), регламентирующие надзор за радиоактивностью, однако актуальной остается разработка методов профилактики и лечения постлучевых поражений органов [1].

Исследования постлучевых поражений поджелудочной железы после облучения заряженными частицами (электроны, протоны) немногочисленны, однако электронотерапия является одним из перспективных методов в радиобиологии и может быть использована для моделирования острого постлучевого панкреатита [2].

Исследователи обнаружили эффективность применения некоторых антиоксидантов для снижения диапазона и глубины постлучевых повреждений поджелудочной железы [3, 4]. Одним из препаратов, обладающих антиоксидантной активностью, является N-аце- тилцистеин, который препятствует развитию оксидативного стресса путем связывания свободных радикалов после воздействия заряженных частиц [5].

В подавляющем большинстве морфологических исследований функциональную оценку эндокринной активности поджелудочной железы осуществляли по уровням двух ключевых гормонов, ответственных за регуляцию углеводного обмена, – инсулина и глюкагона. Некоторые авторы описывали резкое снижение содержания этих гормонов и, как следствие, подтверждали недостаточность эндокринного аппарата поджелудочной железы в модели сахарного диабета после введения, например, стрептозоцина или D-галактозы [6, 7]. Их токсический эффект во многом схож с действием ионизирующего излучения и в большей степени заключается в генерации высоких концентраций свободных радикалов, запускающих гибель клеток поджелудочной железы путем апоптоза.

Однако механизмы радиационно-индуцированного повреждения поджелудочной железы окончательно не раскрыты, а исследования ее эндокринного аппарата после облучения электронами единичны. Кроме того, интересным представляется изучение функционального статуса эндокринных клеток поджелудочной железы, защищенных от воздействия ионизирующего излучения введением N-ацетилцистеина. Полученные результаты в будущем могут послужить основой для разработки эффективных мер профилактики острого постлучевого панкреатита.

Цель исследования. Оценка экспрессии инсулина и глюкагона в панкреатических островках после введения N-ацетилцистеина в модели острого постлучевого панкреатита.

Материалы и методы. Крысы линии Wistar (n=60) были поделены на четыре экспериментальные группы:

I (n=10) – контрольная, в которой вводили раствор NaCl 0,9 %;

• II    (n=20) – фракционное локальное облучение электронами в суммарной облучающей дозе (СОД) 25 Гр;

• III    (n=20) – интраперитонеальное введение N-ацетилцистеина в дозе 120 мг/кг за 1 ч

до локального облучения электронами в СОД 25 Гр;

• IV    (n=10) – интраперитонеальное введение N-ацетилцистеина в дозе 120 мг/кг.

Локальное облучение животных электронами проводили на линейном акселераторе NOVAC-11. Животных всех групп выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика через неделю после последней фракции. Все манипуляции выполняли согласно Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

При проведении гистологического исследования фрагменты поджелудочной железы фиксировали в растворе забуференного формалина, после проводки в автоматическом режиме заливали в парафиновые блоки, готовили серийные срезы (толщиной 2 мкм), депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологические микропрепараты изучали под микроскопом Leica DM2000 с микрофотосъемкой. Оценивали степень повреждения поджелудочной железы по стандартным критериям с применением балльной шкалы от 0 до 3 баллов [8].

При иммуногистохимическом исследовании в качестве первичных использовали поликлональные антитела к цитоплазматическому антигену β-клеток – Insulin (Cell Marque, EP125; 1:300) и цитоплазматическому антигену α-клеток – Glucagon (Cell Marque, 259A-15; 1:100). Для определения вторичных антител применяли универсальную двухкомпонентную систему детекции HiDef Detection™ HRP Polymer system (Cell Marque, США), анти-IgG мыши/кролика, пероксидазу хрена (HRP) и субстрат DAB. Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Подсчет количества иммунопозитивных клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении ×400 (в %). Полученные количественные данные переводили в баллы в соответствии со шкалой: 0 баллов – менее 5 % позитивных клеток в островке поджелудочной железы, 1 балл – 6–25 % позитивных клеток в островке поджелудочной железы, 2 бал- ла – 26–50 % позитивных клеток, 3 балла – более 50 % позитивных клеток в островке поджелудочной железы [9].

Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Данные выражали как среднее значение и стандартное отклонение. Сравнения проводили с использованием дисперсионного анализа. Статистический анализ полученных данных выполняли с помощью теста Крускала – Уоллиса и U-теста Манна – Уитни с поправкой Бонферрони. Различия при p<0,05 считали статистически значимыми.

Результаты. При гистологическом анализе образцов поджелудочной железы через неделю после фракционного локального облучения электронами в СОД 25 Гр были обнаружены признаки острого постлучевого панкреатита: кистозное расширение и вакуолизация ацинусов – 2 балла, фокальный некроз паренхимы – 1 балл, отек – 3 балла, лимфоцитарная инфильтрация – 2 балла, а также геморрагии – 2 балла (рис. 1).

Введение N-ацетилцистеина в III группе привело к снижению диапазона и глубины постлучевого повреждения поджелудочной железы: расширение и вакуолизация ацинусов – 1 балл, фокальный некроз паренхимы – 0 баллов, отек – 2 балла, лимфоцитарная инфильтрация – 1 балл, а также геморрагии – 0 баллов (рис. 1).

При иммуногистохимическом исследовании в панкреатических островках контрольной группы выявили окрашивание эндокринных клеток с антителами к инсулину (3 балла) и глюкагону (2 балла). Через неделю после воздействия фракционного облучения электронами в СОД 25 Гр наблюдали снижение уровней экспрессии инсулина (в 2,2 раза; 2 балла) и глюкагона (в 1,5 раза; 1 балл) по сравнению с контрольной группой. В группе предлучевого введения N-ацетилцистеина через неделю после облучения электронами в СОД 25 Гр количество иммунопозитивных эндокринных клеток было приближено к контрольным значениям: инсулин – в 1,5 раза меньше (2–3 балла), глюкагон – в 1,2 раза меньше (2 балла) (рис. 1). В IV группе не обнаружили достоверных различий по сравнению с контрольной группой как при морфологическом, так и при иммуногистохимическом исследовании (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Иммуногистохимическая характеристика распределения инсулина и глюкагона в панкреатических островках контрольной и опытных групп

Immunohistochemical characteristics of insulin and glucagon distribution in pancreatic islets (control and experiment)

Группа Group	Инсулин, % Insulin, %	Глюкагон, % Glucagon, %
Контроль Control	73,1±3,2	38,4±1,6
Облучение Irradiation	32,7±1,3*	24,5±0,9*
Облучение + N-АЦ Irradiation + N-АC	49,3±2,1*	33,1±1,2*
N-АЦ N-АC	70,6±2,5	36,8±1,5

Примечание. * – статистически значимые различия по сравнению с контролем (р<0,05), N-АЦ – N-ацетилцистеин.

Note. * – the differences are statistically significant compared with the control (р<0.05), N-AC – N-acetyl-cysteine.

Гл.

Glu.

Контроль

Облучение

Облучение + N-АЦ

Control                    Irradiation               Irradiation + N-AC

ГЭ

Инс.

Ins.

Рис. 1. Поджелудочная железа контрольной и опытных групп.

Верхний ряд – морфологическая картина, окрашивание гематоксилином и эозином (ГЭ), ×400.

Средний ряд – иммуногистохимическая картина с антителами к инсулину (Инс.), ×400.

Нижний ряд – иммуногистохимическая картина с антителами к глюкагону (Гл.), ×400.

N-АЦ – N-ацетилцистеин

Fig. 1. Pancreas of control and experimental groups.

Middle row – immunohistochemical picture with insulin (Ins.) antibodies, ×400 magnification.

Bottom row – immunohistochemical picture with glucagon (Glu.) antibodies, ×400 magnification.

N-AC – N-acetylcysteine

Обсуждение. Известно, что ионизирующее излучение запускает прямые (генерация сшивок/разрывов ДНК, хромосомных аберраций) и косвенные (оксидативный стресс в результате генерации активных форм кислорода и азота, других продуктов радиолиза воды, продуктов перекисного окисления липидов и др.) механизмы гибели клеток поджелудочной железы на фоне недостаточности факторов антиоксидантной защиты [10]. Ключевым каскадом в этом процессе считается апоптоз, однако не следует исключать возможности активации и других путей, например ферроптоза, митохондриально-опосредованного некроза и др. [11, 12]. Это сопровождается уменьшением пула функционально активных клеток островков поджелудочной железы с развитием локальных признаков воспаления, что подтверждает обнаруженный нами через неделю после облучения электронами морфологический паттерн, соответствующий острому постлучевому панкреатиту.

Воздействие фракционного облучения электронами приводит к резкому снижению количества функционально активных клеток островков поджелудочной железы, ответственных за синтез двух основных гормонов-антагонистов, обеспечивающих метаболизм глюкозы, – инсулина и глюкагона. Обнаруженные нами иммуногистохимические изменения подтверждают снижение экспрессии этих гормонов в островках поджелудочной железы облученных животных (II группа). Так, можно говорить о значительном уменьшении синтетической активности инсулоци-тов (β-клеток) и глюкагоноцитов (α-клеток) в результате их лучевого повреждения.

Некоторые авторы пришли к выводу, что лучевое повреждение островков поджелудочной железы на поздних сроках может приводить к развитию сахарного диабета на фоне снижения уровня инсулина плазмы крови [13, 14]. Кроме того, Х-облучение всего тела в дозе 6 Гр в эксперименте на мышах увеличивало риск отдаленного развития инсулинорези-стентности, изменения эпигенома и нарушения деления прогениторных клеток, особенно у животных, находящихся на высокожировой диете [15]. Несмотря на то что облучение электронами в нашем исследовании было локальным, что снижает риск развития инсулинорезистент-ности в жировой ткани и скелетных мышцах (в отличие от Х-облучения всего тела), не исключено увеличение риска развития сахарного диабета в отдаленные сроки, связанного со снижением активности эндокринного аппарата поджелудочной железы. Однако необходимо проведение дальнейших, более детальных исследований с применением современных методов молекулярно-генетического анализа.

На основании перечисленных выше механизмов радиационной гибели эндокринных клеток поджелудочной железы можно говорить о ведущей роли оксидативного стресса в этом процессе. Ввиду несостоятельности за- щитно-приспособительных механизмов антиоксидантной системы целесообразным представляется применение субстратов, обладающих антиоксидантной активностью, одним из которых, вероятно, является N-ацетилцистеин, что подтверждается результатами, полученными в нашем исследовании, и работами других авторов.

Механизм антиоксидантного действия N-ацетилцистеина в поджелудочной железе окончательно не изучен, однако можно предполагать, что он заключается в индукции физиологической защиты организма и связывании продуктов радиолиза воды, что оказывает тормозное влияние на генерацию новых цитотоксичных свободных радикалов [16, 17]. Хотя точное раскрытие механизмов антиоксидантного действия N-ацителцистеина и нуждается в проведении новых исследований, посвященных молекулярно-биологической оценке его свойств, наше исследование в сочетании с единичными результатами, полученными другими авторами [18], демонстрирует вероятный протективный эффект предлуче-вого введения этого препарата с незначительной степенью радиационно-индуцированных морфологических и иммуногистохимических изменений по сравнению с группой контроля.

Заключение. При иммуногистохимическом исследовании функционального статуса α- и β-клеток поджелудочной железы было выявлено, что локальное облучение электронами в СОД 25 Гр через неделю приводит к снижению их эндокринной активности, которая частично сохраняется после предлучевого введения N-ацетилцистеина, что указывает на его протективный эффект.