Особенности эпикутанного действия гексилового эфира 5-аминолевулиновой кислоты

Автор: Власенко Е.К., Сычик С.И., Ильюкова И.И., Стельмах В.А., Грынчак В.А.

Журнал: Анализ риска здоровью @journal-fcrisk

Рубрика: Экспериментальные модели и инструментальные исследования для оценки риска в гигиене и эпидемиологии

Статья в выпуске: 1 (9), 2015 года.

Бесплатный доступ

Изучена подострая токсичность гексилового эфира 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК) при эпикутанном воздействии в эксперименте на белых крысах. Установлено, что повторные аппликации гексилового эфира АЛК (ГЭ-АЛК) вызывают слабую реакцию кожных покровов белых крыс в виде отека. Трансдермальный путь поступления ГЭ-АЛК характеризуется повышением активности аланинаминотрансферазы, увеличением уровня мочевины в сыворотке крови и сдвигом в кислую сторону рН мочи подопытных животных. Экспозиционная доза 341 мг/кг является действующей с минимальными отклонениями показателей и принята в качестве пороговой. Экспозиционная доза 75 мг/кг не вызывает изменений состояния лабораторных животных и является максимально недействующей.

Еще

Токсичность, гексиловый эфир 5-аминолевулиновой кислоты, эпикутанное воздействие

Короткий адрес: https://sciup.org/14237897

IDR: 14237897

Текст научной статьи Особенности эпикутанного действия гексилового эфира 5-аминолевулиновой кислоты

Одним из приемов современных агрономических технологий в растениеводстве является применение регуляторов роста растений для повышения урожайности сельскохозяйственных культур. При разработке и производстве таких препаратов особое внимание должно уделяется их экологической безопасности. Принципиально новым подходом к созданию экологически чистых регуляторов роста растений является использование для этих целей естественных метаболитов самих растений, в частности 5-аминолевулиновой кислоты (АЛК). АЛК является исходным интермедиатом всех циклических (хлорофиллов, гемов, корринои-дов) и линейных (билинов, фикобилинов) тетрапирролов, которые играют исключительную роль в метаболизме растительных, животных и бактериальных организмов [5]. В конце 80-х гг.

прошлого столетия впервые было обнаружено, что АЛК обладает свойствами регулятора роста [4]. Эффективность АЛК существенно повышена путем липофилизации молекулы при применении ее в виде эфиров с высшими спиртами, что реализовано учеными Института био-органической химии НАН Беларуси в результате разработки лабораторной методики получения гексилового эфира АЛК (ГЭ-АЛК). В полевых экспериментах было установлено, что применение ГЭ-АЛК оказывает положительный эффект на рост и развитие растений по ряду показателей, при этом эффект достигался при концентрациях в 5 раз (и более) меньших, чем при обработке АЛК [2].

Для безопасного применения ГЭ-АЛК в агропромышленном комплексе необходима его полная токсиколого-гигиеническая оценка, что

позволит минимизировать риски для здоровья работающих в сельском хозяйстве и на производстве. Особая роль в этом отводится токсикологическим экспериментам на лабораторных животных, итогом которых является определение ведущего признака вредного действия и установление пороговых доз или концентраций.

Цель данной работы – изучение особенностей эпикутанного воздействия ГЭ-АЛК, поскольку его попадание на кожные покровы может представлять потенциальную опасность. В ходе эксперимента оценивали проявление местно-раздражающих и кожно-резорбтивных свойств при повторных аппликациях белым крысам.

Материалы и методы. Исследование проведено в повторных опытах на 28 самцах рандомбредных белых крыс массой 180–215 г на протяжении 1 месяца. В эксперимент отбирали здоровых животных с чистым шерстным покровом после внутригрупповой адаптации. За сутки до начала эксперимента крысам выстригали шерсть на спине. Животные были взвешены и разделены на четыре группы по 7 особей: I – контрольную и II, III, IV – опытные, подвергавшиеся экспозиции 50 %, 25 %, 5 % (m/V) растворами ГЭ-АЛК соответственно. Контрольной группе крыс наносили растворитель – дистиллированную воду. Изучение местнораздражающих и кожно-резорбтивных свойств проводили путем нанесения 320 мкл ГЭ-АЛК на выстриженные участки кожи размером 4x4 см в водном растворе (0,02 мл/см2). Животных подвергали экспозиции в течение 4 часов 5 дней в неделю. По окончании ежедневной экспозиции вещество смывали теплой водой. Доступ к корму и воде был свободным, световой режим естественным. На протяжении эксперимента оценивали признаки системной токсичности, локальные изменения. Выраженность эритемы оценивали визуально в баллах: отсутствие – 0, слабая – 1, умеренно выраженная – 2, выраженная – 3, резко выраженная – 4. Величину отека кожи определяли путем измерения толщины кожной складки микрометром (в мм), его интенсивность по сравнению с фоновым значением оценивали по шкале от 0 до 4 баллов [3]. По окончании эксперимента крыс взвешивали и после мгновенной декапитации определяли коэффициенты массы органов, макроскопически оценивали изменения внутренних органов. Полученную кровь тестировали с помощью гематологического анализатора Mythic18 (Швейцария), биохимические показатели сыворотки крови и мочи определяли на автоматическом анализаторе Accent200 (Польша). Коэффициент де Ритиса, клиренсы креатинина и мочевины рассчитаны стандартными методами [1].

Анализ данных на соответствие закону нормального распределения проведен с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. При оценке различий между группами использовали параметрический t -критерий Стьюдента с учетом поправки Бонферрони. Количественные параметры представлены в виде среднего значения ( М ) и 95%-ного доверительного интервала (95%-ный ДИ). Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез был принят р ≤0,05.

Результаты и их обсуждение. Среднее значение экспозиционной дозы в пересчете на массу животного на 30-е сутки эксперимента составило для групп: II – 864 (821–906) мг/кг, III – 341 (318–363) мг/кг, IV – 75 (70–81) мг/кг ГЭ-АЛК.

При изучении местно-раздражающего действия ГЭ-АЛК на протяжении 30 суток эксперимента не отмечено признаков гиперемии и заметных изменений кожных покровов подопытных животных. Участки кожи в местах аппликаций были аналогичны контрольным, не имели уплотнений, шелушений и инородных образований. К концу эксперимента у всех животных определяли толщину кожной складки (табл. 1).

Таблица 1

Результаты измерения толщины кожной складки белых крыс, подвегнутых эпикутанному воздействию ГЭ-АЛК в течение 30 суток, мм, М (±95%-ный ДИ)

Группа	Величина толщины кожной складки, мм		Увеличение толщины кожной складки
Группа	до начала эксперимента	на 30-е сутки эксперимента	за время эксперимента, мм	по сравнению с контролем, %
I (контрольная)	1,4 (1,3–1,6)	1,6 (1,5–1,8)	0,19 (–0,03–0,4)	100
II	1,3 (1,2–1,5)	1,7 (1,6–1,8)	0,37 (0,17–0,57), р =0,68	195
III	1,6 (1,4–1,8)	1,8 (1,7–2,0)	0,24 (0,02–0,46), р =1,0	126
IV	1,6 (1,5–1,7)	1,8 (1,6–1,9)	0,16 (0,02–0,3), р =1,0	84

Таблица 2

Динамика изменения живой массы белых крыс, подвегнутых эпикутанному воздействию ГЭ-АЛК в течение 30 суток, кг^–1, М (±95%-ный ДИ)

Группа	Масса тела животных, кг^–1		Прирост массы тела
Группа	до начала эксперимента	на 30-е сутки эксперимента	за время эксперимента, кг^–1	по сравнению с контролем, %
I (контрольная)	186,4 (182,0–190,8)	210,0 (195,9–224,1)	23,6 (12,7–34,5)	100
II	181,4 (177,9–184,9)	185,7 (176,7–194,7)	4,3 (–6,2–14,8), р =0,11	18
III	200,7 (192,1–209,3)	235,7 (220,8–250,7)	35,0 (23,4–46,6), р =0,86	148
IV	197,9 (192,6–203,1)	214,3 (197,5–231,1)	16,4 (–1,4–34,3), р =1,0	69

Как видно из данных табл. 1, ГЭ-АЛК не вызывал статистически значимых отклонений в толщине кожной складки между контрольной и опытными группами. Вместе с этим, учитывая дозозависимый эффект, считаем возможным поставить 1 балл (слабая реакция) группе II по показателю интенсивности отека, разница по сравнению с контролем которого составляет 0,18 мм, или 195 %. Визуально признаки эритемы отсутствовали во всех группах (0 баллов). Таким образом, суммарная количественная оценка степени индукции эритемы и отека для I группы и III, IV групп, получавших 25 % и 5 % ГЭ-АЛК, составляет 0 баллов, а для II группы крыс, получавших 50 % ГЭ-АЛК, – 1 балл.

При исследовании кожно-резорбтивных свойств ГЭ-АЛК установлено, что 30-кратные эпикутанные аппликации ГЭ-АЛК не приводят к гибели подопытных животных. Общее состояние животных было удовлетворительным, отклонений в поведенческой активности не за- регистрировано. При патолого-анатомическом вскрытии видимых изменений внутренних органов не обнаружено.

Во всех подопытных группах отмечен прирост массы тела к концу эксперимента. Наименьший прирост зафиксирован в группе II, получавшей 50 % раствор ГЭ-АЛК. Следует отметить, что отдельные особи групп II и IV имели отрицательную динамику прироста массы тела по сравнению с исходными данными (табл. 2).

Отличия в приросте массы тела на 30-е сутки эксперимента в контрольной и опытных группах не являются статистически значимыми, дозозависимый эффект отсутствует.

Биохимические показатели сыворотки крови и мочи, а также морфологический состав крови наиболее полно отображают состояние обмена веществ. Как видно из табл. 3, морфофункциональные показатели крови животных групп, получавших в течение 30 суток накожно ГЭ-АЛК, не отличались от контроля.

Таблица 3

Морфофункциональные показатели крови белых крыс, подвегнутых эпикутанному воздействию ГЭ-АЛК в течении 30 суток, М (±95%-ный ДИ)

Показатель	Группа
Показатель	I	II	III	IV
Лейкоциты, 10⁹ кл/л	14,6 (9,3–19,3)	21,2 (12,2–30,2), р =0,46	15,7 (9,9–21,4), р =1,0	12,4 (6,0–18,9), р =1,0
Лимфоциты, 10⁹ кл/л	9,6 (6,1–13,2)	15,5 (6,8–24,3), р =0,33	9,0 (6,2–11,8), р =1,0	7,6 (4,6–10,5), р =1,0
Моноциты, 10⁹ кл/л	0,57 (0,44–0,69)	0,7 (0,52–0,88), р =0,76	0,6 (0,4–0,7), р =1,0	0,5 (0,3–0,8), р =1,0
Гранулоциты, 10⁹ кл/л	4,4 (3,3–5,6)	4,9 (4,4–5,5), р =1,0	6,1 (0,8–11,4), р =1,0	4,4 (1,0–7,7), р =1,0
Эритроциты, 10¹² кл/л	7,9 (7,5–8,3)	8,3 (7,9–8,7), р =0,89	7,6 (7,1–8,0), р =0,88	7,8 (7,0–8,6), р =1,0
Концентрация гемоглобина, г/л	143,3 (136,0–150,6)	153,2 (143,2–163,2), р =0,4	135,3 (125,0–145,6), р =0,77	144,5 (131,9–157,1), р =1,0
Гематокрит, л/л	0,38 (0,37–0,39)	0,4 (0,38–0,42), р =0,57	0,36 (0,33–0,39), р =1,0	0,38 (0,34–0,42), р =1,0
Средний объем эритроцита, фл	47,9 (46,2–49,6)	48,5 (46,9–50,1), р =1,0	47,7 (46,2–49,2), р =1,0	48,7 (46,8–50,6), р =1,0
Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг	18,1 (17,0–19,2)	18,5 (17,6–19,3), р =1,0	17,9 (17,4–18,4), р =1,0	18,6 (18,2–19,0), р =1,0
Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, г/л	377,8 (367,4–388,3)	381,0 (376,3–385,7), р =1,0	375,0 (370,9–379,0), р =1,0	380,5 (366,7–394,3), р =1,0
Тромбоциты, 10⁹ кл/л	677,5 (462,8–892,2)	519,2 (358,6–679,7), р =0,57	540,8 (451,8–629,8), р =0,87	566,5 (318,1–814,9), р =1,0
Средний объем тромбоцита, фл	6,3 (5,8–6,8)	6,3 (5,9–6,8), р =1,0	6,3 (6,1–6,5), р =1,0	6,2 (5,5–6,9), р =1,0

Таблица 4

Биохимические показатели сыворотки крови белых крыс, подвегнутых эпикутанному воздействию в течение 30 суток, М (±95%-ный ДИ)

Показатель	Группы с		равнения
Показатель	I	II	III	IV
Общий белок, г/л	78,8 (67,1-90,5)	63,8 (45,5-82,0), р =0,56	63,6 (49,8-77,5), р =0,54	90,0 (62,7-117,3), р =1,0
Альбумин, г/л	48,5 (36,5-60,5)	52,7 (39,6-65,7), р =1,0	45,1 (31,9-58,3), р = 1,0	37,5 (13,0-61,9), р =1,0
Мочевина, мМоль/л	6,8 (6,0-7,6)	8,3 (7,1-9,5) *, р =0,032	6,5 (5,8-7,2), р =1,0	7,6 (7,0-8,3), р =0,9
АЛТ, мккат/л	1,62 (1,43-1,8)	1,97 (1,73-2,22)*, р =0,045	2,1 (1,91-2,22)*, р =0,002	1,72 (1,55-2,23), р =0,99
АСТ, мккат/л	5,16 (4,39-5,92)	6,31 (5,06-7,55), р =0,28	5,88 (5,09-6,67), р =1,0	6,92 (5,33-8,52), р =0,053
Коэффициент де Ритиса, усл.ед.	3,24 (2,63-3,85)	3,20 (2,70-3,70), р =1,0	2,79 (2,52-3,06), р =0,34	3,11 (2,60-3,63), р =1,0
Холестерин, мМоль/л	1,9 (1,4-2,4)	1,9 (1,7-2,2), р =1,0	1,2 (1,1-1,4) *, р =0,01	1,8 (1,3-2,4), р =1,0
Креатинин, мкМоль/л	43,0 (40,4-45,6)	40,31 (37,9-42,7), р= 0,18	41,1 (38,2-44,0), р =0,81	40,2 (38,1-41,9), р =0,14
Мочевая кислота, мкМоль/л	75,7 (58,9-92,4)	101,5 (80,7-122,3), р =0,19	87,5 (69,6-105,4), р =1,0	86,0 (45,6-126,4), р =1,0
а-амилаза, мккат/л	16,0 (12,65-19,34)	13,97 (10,12-17,82), р =1,0	14,35 (9,89-18,81), р =1,0	14,55 (11,34-17,76), р =1,0
Щелочная фосфатаза, мккат/л	1,85 (1,64-2,06)	1,81 (1,76-1,85), р =1,0	1,95 (1,78-2,11), р =1,0	1,83 (1,64-2,03), р =1,0
Глюкоза, мМоль/л	6,6 (5,5-7,7)	7,3 (6,5-8,1), р =1,0	7,6 (7,1-8,2), р =0,42	7,3 (5,0-9,6), р =1,0
Кальций, мМоль/л	5,0 (4,5-5,5)	5,1 (4,7-5,5), р =1,0	4,6 (4,2-4,9), р =1,0	6,7 (1,8-11,7), р =0,35
Магний, мМоль/л	0,94 (0,82-1,1)	0,98 (0,9-1,1), р =1,0	0,89 (0,79-1,0), р =1,0	0,99 (0,81-1,2), р =1,0
ЛДГ, мккат/л	82,1 (51,9-112,3)	78,7 (50,7-106,8), р =1,0	58,9 (46,0-71,7), р =0,56	62,0 (35,5-88,4), р =1,0
ГГТ, мккат/л	0,19 (0,16-0,21)	0,19 (0,18-0,2), р =1,0	0,19 (0,17-0,22), р =1,0	0,19 (0,17-0,2), р =1,0

П р и м е ч а н и е: * - различия статистически достоверны, р <0,05.

Таблица 5

Показатели мочевыделительной системы белых крыс, подвегнутых эпикутанному воздействию ГЭ-АЛК в течение 30 суток, М (±95%-ный ДИ)

Показатель	Группы
Показатель	I	II	III	IV
Общий белок, г/л	7,5 (3,6-11,4)	10,3 (5,4-15,1), р =1,0	8,2 (5,2-11,1), р =1,0	8,1 (0,1-16,2), р =1,0
Мочевина, мМоль/л	96,7 (32,7-160,6)	150,3 (90,2-210,4), р =0,94	134,7 (58,3-211,8), р =1,0	126,8 (35,9-217,6), р =1,0
Клиренс мочевины, мл/мин	0,12 (0,07-0,17)	0,11 (0,06-0,17), р =0,94	0,10 (0,06-0,14), р =1,0	0,12 (0,09-0,15), р =1,0
Креатинин, мМоль/л	4,8 (2,4-7,1)	3,8 (3,1-4,5), р =1,0	3,1 (2,5-3,6), р =0,3	7,1 (4,7-9,6), р =0,33
Клиренс креатинина, мл/мин	0,68 (0,44-0,98)	0,67 (0,51-0,83), р =1,0	0,81 (0,48-1,15), р =1,0	0,75 (0,57-0,92), р =1,0
Мочевая кислота, мкМоль/л	456,5 (184,6-728,4)	826,3 (634,7-1017,9), р =0,22	908,5 (514,2-1302,9), р =0,08	762,0 (315,5-1208,6), р =0,67
Глюкоза, мМоль/л	0,95 (0,63-1,26)	1,1 (0,97-1,3), р =1,0	1,1 (0,63-1,6), р =1,0	1,3 (0,99-1,7), р =0,45
Кальций, мМоль/л	3,3 (3,1-3,6)	5,1 (3,8-6,4), р =0,2	4,0 (2,0-6,0), р =1,0	3,7 (1,4-6,1), р =1,0
Магний, мМоль/л	2,1 (1,5-2,8)	2,4 (2,1-2,7), р =1,0	2,5 (1,4-3,5), р =1,0	2,4 (1,9-2,8), р =1,0
Диурез, л^-3/сут.	13,8 (8,6-19,1)	9,6 (6,5-12,7), р =0,3	8,2 (3,9-12,5), р =0,18	12,7 (6,1-19,4), р =1,0
рН, ед. рН	7,8 (7,2-8,3)	6,0 (5,7-6,3)*, р =0,0001	6,1 (5,9-6,3)*, р =0,00008	6,9 (5,9-7,9), р =0,23

П р и м е ч а н и е: * - различия статистически достоверны, р <0,05.

Среди биохимических показателей сыворотки крови подопытных животных отмечено повышение ферментативной активности АЛТ в II группе на 21,6 % и в III - на 29,6 % по срав- нению с контролем; увеличение содержания мочевины на 22 % обнаружено в сыворотке животных II опытной группы; уровень холестерина снижен в крови животных III группы и составляет 63 % от контрольного (табл. 4). В данном эксперименте снижение уровня холе- стерина в сыворотке крови крыс не имеет дозовой зависимости, поэтому не рассматривается в качестве показателя токсического действия.

Со стороны состояния мочевыводящей системы отмечалось снижение величины показателя водородных ионов на 30-е сутки эксперимента в моче животных групп II и III (табл. 5), что, вероятнее всего, связано с индуцируемым ГЭ-АЛК изменением кислотнощелочного равновесия.

Выводы. В результате проведенного эксперимента установлено, что при повторном эпикутанном воздействии ГЭ-АЛК вызывает слабую реакцию кожных покровов белых крыс в виде отека. Трансдермальный путь поступления ГЭ-АЛК характеризуется повышением активности АЛТ, увеличением уровня мочевины в сыворотке крови и сдвигом в кислую сторону рН мочи подопытных животных.

Экспозиционная доза 341 мг/кг является действующей с минимальными отклонениями показателей, а доза 75 мг/кг не вызывает изменений состояния лабораторных животных в течение 30 суток. Таким образом, доза 341 мг/кг может быть принята в качестве пороговой при повторном накожном воздействии ГЭ-АЛК.

Список литературы Особенности эпикутанного действия гексилового эфира 5-аминолевулиновой кислоты

Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. -822 с.
Стимуляция роста и развития растений ячменя липофильными эфирами 5-аминолевулиновой кислоты/С.Г. Спивак, Е.Б. Яронская, И.В. Вершиловская, В.Ю. Давыдов, И.В. Тростянко, В.И. Долгопалец, Н.Г. Аверина, М.А. Кисель//Докл. Нац. акад. наук Беларуси. -2007. -Т. 51, № 5. -С. 95-99.
Требования к постановке экспериментальных исследований для первичной токсикологической оценки и гигиенической регламентации веществ: инструкция/утв. Министерством здравоохранения Респ. Беларусь 14.12.2004 г. -Минск, 2004. -43 с.
Averina N.G., Yaronskaya E.B. Involvement of 5-aminolevulinic acid in the regulation of plant growth//Photosynthetica. -1991. -Vol. 25, № 1. -P. 27-31.
Beale S.I., Weinstein J.D. Biochemistry and regulation of photosynthetic pigment formation in plants and algae//Biosynthesis of Tetrapyrroles (New Comprehensive Biochemistry Series)/Ed.: P.M. Jordan. -Elsevier. -Amsterdam, The Netherlands, 1991. -Vol. 19. -P. 155-235.

Статья научная