Особенности клонального микроразмножения сортов клематиса (Clematis L.)

Введение. Клематис ( Clematis Dill, exL., 1753), или Ломонос, очень популярная культура, которая широко используется в вертикальном озеленении и садоводстве. Это многолетняя одревесневающая красивоцветущая лиана, способная достигать в длину нескольких метров. Стебель лазящий. Листья расположены супротивно. Цепляется за опору черешком листа. Цветение обильное и очень продолжительное в середине лета. У клематиса выведено много сортов, наряду с которыми до сих пор очень популярны и видовые растения. Регистрацией новых сортов занимаются в Англии в «Королевском садоводческом обществе» (RHS) [1].

Клематисы светолюбивы, теплолюбивы, влаголюбивы и очень требовательны к плодородию почв. Некоторые популярные сорта в условиях средней полосы нуждаются в легком укрытии и соответствующей обрезке. В основном к таким относятся махровые и крупноцветковые сорта. А большинство мелкоцветковых и видовых на зиму даже не снимают с опоры [1, 2].

В нашей работе изучено 10 сортов из коллекции плодовой станции РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева (табл. 1). Всего в коллекции 30 сортов. Маточные растения выращивают в зимней остекленной теплице, в грядах, с подвязкой к опоре.

Таблица 1

Описание изучаемых сортов клематиса коллекции плодовой станции РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Название, сорт (сокращ. в работе)	Описание, группа обрезки
1	2
Kakio (К)	Немахровый, крупный цветок, в диаметре 12–16 см. Окраска – розовая, с белой полосой в центре лепестка. Длина лианы 2,5–3,0 м. Вторая группа обрезки
Blue Light (BL)	Цветки густомахровые, крупные, в диаметре 11–15 см. Окраска цветка – светло-лавандовая. Длина лианы 2 м. Вторая группа обрезки
Dancing Dorien (DDOR)	Цветки махровые, 6–8 см в диаметре. Окраска белая, тычинки и пыльники – кремовые. Длина лианы 1,5–2,0 м. Вторая группа обрезки. Очень зимостойкий сорт
Princess Diana (PRDI)	Цветки мелкие, колокольчатые, 3–5 см в диаметре. Окраска темно-розовая. Длина лианы 2,5–3,0 м. Третья группа обрезки
Purpurea Plena Elegans (PPE)	Цветки густомахровые, средние по размеру, в диаметре 3–5 см, малиноворозовые. Цветение обильное. Длина лианы 3,0–3,5 м. Третья группа обрезки

Окончание табл. 1

1	2
Julka (JL)	Цветок простой, очень крупный, в диаметре до 14 см. Окраска цветка – темно-фиолетовая с бордовой полосой в центре. Тычинки белые. Длина лианы до 2 м. Вторая группа обрезки
Proteus (PR)	Цветки крупные, до 18 см в диаметре, простые и полумахровые. Края лепестков волнистые. Окраска от бледно- до темно-фиолетовой. Длина лианы до 2,5 м. Третья группа обрезки. Сорт практически не поражается грибными заболеваниями
Polish Spirit (PS)	Цветок простой, крупный, в диаметре до 10 см. Окраска цветка темнофиолетовая. Длина лианы 2,5–3,0 м. Третья группа обрезки
Innocent Blush (IB)	Цветки на прошлогодних побегах махровые от светло-розовых до темнорозовых. Цветки на побегах текущего года простые, до 12 см в диаметре. Пыльники ярко-желтые. Длина лианы до 2 м. Вторая группа обрезки
Daniel Deronda (DDER)	Цветки крупные, до 12 см, простые, на побегах прошлого года полумахро-вые. Окраска голубовато-фиолетовая. Пыльники кремовые. Длина лианы 2,0–2,5 м. Первая группа обрезки

На одном месте в условиях открытого грунта клематис растет до 30 лет, в защищенном грунте маточные растения клематиса требуется омолаживать через 5–10 лет, в связи с тем, что существенно снижается выход зеленых черенков с маточных растений [3].

В связи с возрастающим спросом на посадочный материал сортов клематиса становится актуальным применение новых инновационных технологий ускоренного размножения [4, 5].

Метод клонального микроразмножения позволяет быстро обновить маточники клематиса, получить большое количество посадочного материала, а также оздоровить полученный посадочный материал от вирусов и болезней [6].

Цель работы. Совершенствование методики размножения in vitro клематиса в соответствии с требованиями конкретных сортов.

На первом этапе работы стояли следующие задачи : введение в культуру 10 сортов клематиса; использование двух вариантов питательных сред на этапе собственно микроразмножения для изучаемых сортов.

Материалы и методы. В эксперименте использовали 10 сортов клематиса, характеризующихся разной способностью к укоренению in vivo. В качестве эксплантов брали конус нарастания (апекс) с листовыми примордиями, взятыми с молодых нарастающих побегов. Забор верхушек осуществлялся в июне.

Верхушки побегов сначала промывали 15 минут под проточной водой с добавлением поверхностно-активных веществ, потом погружались в 70%-й спирт на 2–3 секунды, далее проводили стерилизацию с помощью 3%-го гипохлорита натрия в течение 10 минут. Промытые дистиллированной стерилизованной водой апексы помещали на искусственную питательную среду в условиях ламинар-бокса. Питательную среду автоклавировали при 118 °С 18 минут и разливали в условиях ламинар-бокса в пробирки объемом 10 мл. Культуры инкубировали в световой комнате при интенсивности света 2000 люкс, температуре 24 °С и 16часовом фотопериоде.

На этапе введения использовали питательную среду MS (Murashige, Skoog, 1962), содержащую микро- и макросоли, витамины (мг/л): тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота – по 0,5; инозитол – 100; глицин – 2; сахароза – 30000; бакто-агар – 7000 с добавлением гормона БАП (0,4 мг/л) и ИМК (0,05 мг/л).

На этапе размножения среду разливали в стеклянные банки с объемом среды 30 мл. Все сорта высаживали на два типа питательных сред.

• 1.    Питательная среда на основе минеральных солей QL (Quoirin & Lepoivre, 1977), содержащая следующие вещества (мг/л): витамины тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота

  – по 0,5; инозитол – 100; глицин – 2; сахароза – 30000; бакто-агар – 7000 с добавлением гормона БАП (0,4 мг/л) и ИМК (0,05 мг/л).

• 2.    Питательная среда на основе минеральных солей MS (Murashige, Skoog, 1962), содержащая следующие вещества(мг/л): витамины тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота – по 0,5; инозитол – 100; глицин – 2; сахароза – 30000; бакто-агар – 7000 с добавлением гормона БАП (0,4 мг/л) и ИМК (0,05мг/л).

Концентрация гормона БАП (0,4 мг/л) и ИМК (0,05 мг/л) была выбрана на основе ранее сделанных исследований.

В ходе эксперимента учитывали следующие показатели: коэффициент размножения (суммарное количество одноузловых черенков с одного конгломерата), высоту микропобегов.

Результаты и их обсуждение. Исследования показали, что реакция сортов на условия in vitro зависела от генотипа сорта и состава питательной среды. Инициация длилась 2 месяца, темпы роста и тип размножения зависели от сорта. На этапе введения из 10 сортов ввели 10. Контаминация, или зараженность среды грибными инфекциями, – важный показатель, характеризующий количество прижившихся апексов (рис.).

Определение контаминации (зараженности) питательной среды на этапе введения в пробирках, %

Лучшей приживаемостью (80–100 %) отличались апексы сортов Blue Light, Kakio, Dancing Dorien, Princess Diana, Purpurea Plena Elegans, Proteus, Innocent Blush, Daniel Deronda. Самой низкой контаминацией характеризуются сорта Polisch Spirit (40%), Julka (35%), Princess Diana (30%), соответственно выход прижившихся апексов у них невысокий.

В опыте наблюдали прямую зависимость приживаемости апексов от их размера. С увеличением размера экспланта увеличивалась их способность к регенерации. У эксплантов, взятых с верхушек донорных растений, отмечали интенсивный рост, в то же время использование боковых побегов в качестве исходного материала для выделения эксплантов приводило к задержке роста и развития стерильных культур.

Таблица 2

Сорт	Длина побегов, см	Кол-во побегов на эксплант, шт.	Длина междоузлий, см	Коэффициент размножения
Kakio	2,1	1,2	0,5	5,0
Blue Light	2,7	1,6	0,5	6,4
Dancing Dorien	0,5	1,1	0,3	1,8
Princess Diana	3,1	1,3	0,9	4,5
Purpurea Plena Elegans	4,8	1,4	0,5	7,8
Julka	1,1	1,2	0,3	4,4
Proteus	0,9	1,1	0,4	2,5
Polish Spirit	2,0	1,5	0,7	4,2
Innocent Blush	1,6	1,1	0,4	4,4
Daniel Deronda	1,9	1,6	0,5	6,1
НСР 05	0,1	0,2	0,1	0,6

Коэффициент размножения на этапе введения в пробирках

По результатам статистической обработки данных можно сделать вывод, что различия сортов по изучаемым показателям достоверны, за исключением случаев, когда у сортов разница по показателям меньше, чем значение НСР 05 [7].

Инициация культур длилась 2–3 месяца в зависимости от сорта. За это время у части сортов на первичных эксплантах сформировались одиночные побеги. Снятие апикального доминирования при применении гормона 6-БАП было неполным. Побеги сохраняли способность к дальнейшему нарастанию верхушкой. При этом в пазухах листьев из боковых почек формирова- лись боковые побеги второго порядка. При дальнейшем размножении эти побеги могли использоваться в качестве отдельных субъединиц, что значительно увеличивало коэффициент размножения. По сумме показателей лучшим был сорт Purpurea Plena Elegans: коэффициент размножения составил 7,8. Самые низкие показатели продемонстрировали сорта Dancing Dorien и Proteus: коэффициент размножения соответственно 1,8 и 2,5. Далее проводили сравнение коэффициента размножения на двух минеральных питательных средах (табл. 3).

Таблица 3

Сравнительный анализ сортов клематиса на стадии размножения на двух средах

Сорт	Среда	Средняя длина побегов, см	Кол-во побегов на эксплант, шт	Коэффициент размножения
1	2	3	4	5
Kakio	MS	2,3	1,4	4,2
	QL	2,5	1,3	4,3
Blue Light	MS	1,5	1,2	3,4
	QL	1,2	1,2	1,9
Dancing Dorien	MS	2,2	1,6	3,5
	QL	2,6	1,6	2,2
P.P. Elegans	MS	4,5	1,3	5,6
	QL	5,3	1,2	6,8
Julka	MS	2,4	1,6	4,1
	QL	2,6	1,6	4,8

Окончание табл. 3

1	2	3	4	5
Proteus	MS	2,8*	2,3*	3,8
	QL	1,1*	3,1*	4,8
Polish Spirit	MS	4,9	1,6	4,0
	QL	4,6	1,4	3,6
Innocent Blush	MS	2,7	1,2	3,9
	QL	2,4	1,5	4,1
Daniel Deronda	MS	5,0	1,3	4,5
	QL	5,2	1,2	4,9
Princess Diana	MS	4,3*	2,1	3,8
	QL	6,8*	2,5	5,1
НСР 05	-	1,5	0,8	1,8

*Различия сред достоверны.

По полученным данным можно сделать вывод, что для большинства сортов с успехом можно применять обе изучаемые среды. Исключение составляют сорта Princess Diana и Proteus, для которых оптимальна среда QL. Исследования показали, что на среде MS лучше развивались сорта Purpurea Plena Elegans и Daniel Deronda, коэффициент размножения 5,6 и 4,5 соответственно. Коэффициент размножения в среднем по этим сортам составлял 1:5,5. Высокий коэффициент размножения на среде QL отмечен у сорта Purpurea Plena Elegans – 6,8 и у сорта Princess Diana – 5,1. Влияние минеральной основы питательной среды на коэффициент размножения остальных сортов было слабо выражено.

Выводы. Лучшей приживаемостью (80–100 %) отличались сорта Blue Light, Kakio, Dancing Dorien, Princess Diana, Purpurea Plena Elegans, Proteus, Innocent Blush, Daniel Deronda. Самой низкой контаминацией характеризуются сорта Polisch Spirit (40 %), Julka (35 %), Princess Diana (30 %). В опыте наблюдали прямую зависимость приживаемости апексов от их размера. С увеличением размера экспланта увеличивалась их способность к регенерации.

Обе изучаемые минеральные среды не отличались по большинству сортов по коэффициенту размножения. Поэтому для этапа размножения сортов клематиса рекомендуется среда на основе минеральных солей QL (Quoirin & Lepoivre, 1977), содержащая следующие вещества (мг/л): витамины тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота – по 0,5; инозитол – 100; глицин – 2; сахароза – 30000; бакто-агар – 7000 с добавлением гормона БАП (0,4 мг/л) и ИМК

(0,05 мг/л), и питательная среда на основе минеральных солей MS (Murashige, Skoog, 1962), содержащая следующие вещества (мг/л): витамины тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота – по 0,5; инозитол – 100; глицин – 2; сахароза – 30000; бакто-агар – 7000 с добавлением гормона БАП (0,4 мг/л) и ИМК (0,05 мг/л).

На этапе размножения следует выделить сорт Purpurea Plena Elegans, коэффициент размножения которого составил 7,8. Самые низкие показатели продемонстрировали сорта Dancing Dorien и Proteus: коэффициент размножения соответственно 1,8 и 2,5.

В ходе исследования было выявлено, что реакция сортов на условия in vitro на стадии собственно микроразмножения зависела от генотипа и состава питательной среды. Проведенные исследования показали, что оптимизация условий размножения клематисов in vitro в соответствии с особенностями роста и развития конкретного сорта может повысить эффективность микроразмножения.