Особенности консервации актинобактерий рода Rhodococcus

Объектом исследования служили 53 штамма актинобактерий из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН (Каталог штаммов..., 1994; , принадлежащих к шести видам

Rhodococcus (R erythropolis, R. fascians, R. "longus ", R. opacus, R. rhodochrous, R ruber).

Культуры выращивали на мясопептонном агаре (МПА) и в жидкой минеральной среде с пропаном в качестве единственного источника углерода в газовоздушной атмосфере (1:5) (Ившина и др., 1987). Консервацию культур осуществляли методом лиофилизации - высушивания клеток в вакууме из замороженного состояния с помощью лабораторного лиофилизатора типа ОЕ-960 (Венгрия). В качестве лиопротекторов использовали сахарозо-желатиновый агар (СЖА) Файбича (10% сахарозы, 1,5% желатина, 0,1% агара “Difco”), трегалозо-желатиновый агар (ТЖА: 10% трегалозы, 1,5% желатина, 0,1% агара “Difco") и желатиновый агар с добавлением биосурфактанта (БС+ЖА), полученного из штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ 235 (Kuyukina et al., 2001). Количество жизнеспособных клеток определяли методом точечных высевов по числу колониеобразующих единиц (Веслополова, 1'995). Эффективность метода хранения оценивали по показателям выживаемости и биологической . активности поддерживаемых культур. Константы скорости отмирания лиофильно высушенных штаммов родококков и рациональную длительность хранения их в лиофилизированном состоянии рассчитывали по известным формулам (Нестеров и др., 1986; Mikata, Banno, 1989). Проверку сохранения исходных свойств культур осуществляли путем контрольного опреде ления ключевых признаков (Методы общей бактериологии, 1983; Ившина и др., 1995). Все эксперименты проводили в 3-кратной повторности.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета компьютерных программ Microsoft Excel.

-                                 ПО

Результаты и обсуждение

Известно, что успешность лиофилизации и эффективность последующего хранения родококков существенно зависят рт условий предварительного культивирования и наличия протекторного соединения при консервации клеток (Ившина, Каменских и др., 1995; Каменских, Ившина, 2000). Так, изучение жизнеспособности культур, поддерживаемых в течение 2-12 лет в лиофильно высушенном состоянии, показало, что применение сахарозо-желатинового агара (СЖА) в качестве протектора способствует сохранению большого числа жизнеспособных клеток родококков, предварительно выращенных на МПА (табл. 1). При этом необходимо отметить, что наиболее высокая (10⁷-10⁸ клеток/мл) выживаемость бактериальных клеток отмечается у пигментированных культур - представителей видов R. fascians, R. rhodochrous и R. ruber.

Таблица 1 Жизнеспособность родококков после длительного сохранения их в лиофилизированном состоянии

Примечание. Приведены средние данные определения численности (клеток/мл) и 95%-ный доверительный интервал.

Однако выборочная проверка углеводородокис-ляющей способности отдельных штаммов показала выраженное снижение исследуемой активности некоторых культур родококков. В то же время метод лиофилизации бактериальных клеток, предварительно выращенных на пропане, с применением классического протектора (СЖА) приводит к существенному снижению срока гарантированного хранения газоокисляющих родококков (табл. 2). По нашим данным, средний срок рациональной длительности хранения пропанокисляющих штаммов составляет 7,6 лет.

Ранее нами (Каменских, 1998; Каменских, Ившина, 2000) было показано, что повышение степени устойчивости газоокисляющих родококков к длительному хранению в лиофилизированном состоянии может быть достигнуто путем изменения состава защитной среды. В частности, добавление 1 мМ ацетата-а-токоферола в качестве антиоксиданта в состав защитной среды способствует увеличению числа жизнеспособных клеток, осуществляющих окисление пропана. С целью поиска новых эффективных условий консервации алкано-трофных родококков нами было осуществлено предварительное культивирование клеток на среде с пропаном, при этом использовались новые криопротекторы - трегалозо-желатиновый агар и желатиновый агар с добавлением Rhodococcus-бт- сурфактанта - гликолипида трегалозы. В состав , этих соединений входит низкомолекулярный диса-харидный компонент - трегалоза, обладающая эффективным защитным действием (Волков и др., 1992; Israeli et al., 1993; Ivshina et al, 1998; Arguelles, 2000; Kuyukina et al., 2001).

По нашим данным, высокая выживаемость исследуемых культур в процессе лиофилизации достигается при использовании в качестве протектора сахарозо-желатинового или трегалозо-желатинового агара. Как видно из табл. 3, показатель выживаемости родококков R. ruber ИЭГМ 333, предварительно выращенных в присутствии пропана, в этих условиях опыта составляет 37-40%. С целью прогнозирования эффективности данного способа лиофилизации для длительной консервации был использован тест на ускоренное хранение. Для этого при помощи графиков Аррениуса, построенных по экспериментальным данным, определяли величины констант скорости отмирания клеток при температуре +4°С, обычно используемой для хранения лиофилизированных препаратов, а также рассчитывали рекомендуемую продолжительность хранения исследуемых культур в лиофилизированном состоянии (табл. 4). Произведенные расчеты показывают, что рациональная длительность хранения родококков при условии предварительного выращивания их в присутствии пропана и использования в качестве протектора сахарозо-желатинового агара составляет более 5 лет, тогда как применение желатинового агара с добавлением /?/гос/ососсп$-биосурфактанта способствует значительному увеличению прогнозируемого срока хранения - до 18 лет. Учитывая стабилизирующую роль трегалозы при продолжительном хранении бактериальных препаратов в лиофилизированном состоянии, следует отметить, что определяющим ствия с клеточными биополимерами, в частности аспектом, по-видимому, является состояние трега- липидными компонентами (Волков и др., 1992). лозы, которое существенно зависит от взаимодей-

Таблица2

Влияние среды предварительного культивирования на жизнеспособность лиофилизированных культур R. ruber при хранении в течение 1-9 лет

Выживаемость газоокисляющих родококков R. ruber ИЭГМ 333 в зависимости от условий лиофилизации

Примечание. Здесь и в табл. 4 СЖА - сахарозожелатиновый агар; ТЖА - трегалозо-желатиновый агар; БС+ЖА - желатиновый агар с добавлением ЯЛое/ососсмя-биосурфактанта.

Таблица 4

Прогноз выживаемости R. ruber ИЭГМ 333 в зависимости от криопротектора и среды предварительного культивирования родококков