Особенности липидного состава клеточных мембран при коррекции комплексным препаратом "Бифидум баг" в условиях гентамицинассоциированного дисбиоза

Введение. Все внутриклеточные и клеточные биомембраны имеют сходное строение, в их основе лежит двойной молекулярный слой липидов. Эритроцитарная мембрана является удобным модельным объектом, так как имеет общие принципы строения с молекулярной структурой плазматических мембран, поэтому закономерности изменений структуры и функций мембран эритроцитов с незначительной долей коррекции могут быть перенесены на другие мембранные системы [1, 2].

Мембрана эритроцитарной клетки составляет 1 % от веса эритроцита, но именно она определяет гомеостаз и функциональное состояние этой клетки [3]. Даже незначительные изменения структуры и функций биомембраны могут приводить к развитию различных патологических процессов и заболеваний [4].

Вследствие того что в состав мембран эритроцитов входит большое количество химических соединений, они могут служить мишенью для токсинов различной этиологии, ядов и лекарственных препаратов [5]. Доказано, что изменения структуры липидов мембран, их количественного и качественного состава под влиянием различных факторов имеют большое значение для функционального состояния как самих мембран, так и организма в целом [6, 7]. Изменение баланса липидных компонентов биомембран тесно связано с клеточным метаболизмом, с состоянием белков, углеводов и плазменных липидов. Чаще всего эти нарушения происходят при различных патологических состояниях, связанных с типовыми процессами дезинтеграции клеточных структур, что определяет тяжесть течения и продолжительность болезни. При заболеваниях, которые протекают с выраженным гипоксическим синдромом, изменения в структуре мембраны наиболее выражены. Эти нарушения могут наблюдаться при воздействии различных лекарственных препаратов, в частности антибиотиков широкого спектра действия [8].

Цель исследования. Изучение состава липидов мембран эритроцитов в условиях ген-тамицинассоциированного дисбиоза и коррекции его комплексным препаратом «Бифидум БАГ».

Материалы и методы. Исследование проведено на 60 мышах линии BALB/c с массой 18–20 г, которые содержались в стандартных условиях вивария. Животные были разделены на три группы по 20 особей в каждой. Первая группа – контрольная (интактные мыши). Вторую группу составили животные, которым моделировали гентамицинассоции-рованный дисбиоз путем ежедневного (в течение 5 дней) внутрибрюшинного введения раствора гентамицина в концентрации 80 мкг/мл в пересчете на массу животного (0,02 мл) [9]. Животные третьей группы интрагастрально получали комплексный пробиотик «Бифидум БАГ» в течение 21 дня 1 раз в сутки после формирования стойкого лекарственного дисбактериоза. Исследования проводили с соблюдением всех принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, ис- пользуемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).

Забор крови животных производили в чистую пробирку, предварительно добавляя 1–2 капли гепарина, распределяя его по стенкам, после добавляли 2 мл крови. Центрифугировали при 1500 об. в течение 20 мин. Экстракцию липидов проводили из чистой эритроцитарной массы в количестве 0,5 мл с помощью последовательного добавления 0,5 мл дистиллированной воды, 5,5 мл изопропанола и 3,5 мл хлороформа с промежутком времени в один час, интенсивно перемешивали на вибромешалке. После чего полученный экстракт был отфильтрован через бумажный фильтр [10]. Липидный состав эритроцитов определяли традиционными методами. Хроматографирование проводили по методу В.И. Крылова [11] в насыщенных парами растворителей камерах на пластинках Silufol (Россия). Определение липидных фракций проводили с использованием стандартных образцов нейтральных липидов (моноглицериды (МГ), диглицериды (ДГ), холестерин (ХС), свободные жирные кислоты (СЖК), триглицериды (ТГ), эфиры холестерина (ЭХС)) и фосфолипидов (лизофосфоти-дилхолин (ЛФХ), фосфатидилинозитол/серин (ФИ/ФС), фосфатидилхолин (ФХ), сфингомиелин (СМ), кардиолипин (КЛ), фосфатидил-этаноламин (ФЭ)) производства фирмы Sigma (США) путем детерминации относительной подвижности фракций. Денситометрическим методом определяли уровень содержания липидов на ПЭВМ IBM PA/AT с использованием программы OneDscan в отраженном свете [12–14]. Обработку результатов осуществляли по стандартным методикам вариационной статистики. С помощью критерия Колмагорова–Смирнова была проведена проверка всех данных на нормальность распределения признака. При этом если полученные p для данного статистического теста были выше критического (p=0,05), то распределение считали подчиняющимся закону нормального распределения. Из этого следовало, что для дальнейшего статистического анализа использовались параметрические методы обсчета данных. Для описания количественных признаков использовались параметры нормального распределения: стандартная ошибка среднего значения (±m), среднее значение (M), дисперсия (σ²), стандартное отклонение (σ). Проверку статистических гипотез проводили с помощью критерия Стьюдента (t). Пороговый уровень статистической значимости принимали равным 0,05 [15].

Результаты и обсуждение. После формирования гентамицинового дисбиоза были выявлены следующие изменения в составе фос фолипидов (табл. 1).

Таблица 1

Table 1

Количественные характеристики мембранных фосфолипидов эритроцитов крови мышей в условиях экспериментального дисбиоза и его коррекции препаратом «Бифидум БАГ»

Quantitative characteristics of membrane phospholipids of blood erythrocytes in mice under experimental dysbiosis and its correction with Bifidum BAG

Фосфолипиды (M±m) Phospholipids (M±m)	Контроль (интактные мыши) Control (intact mice)	Дисбиоз Dysbiosis	Коррекция «Бифидум БАГ» Correction with Bifidum BAG
Лизофосфатидилхолин Lysophospatidylcholine	2,82±0,40	6,31±0,42***	4,61±0,37хх
Сфингомиелин Sphingomyelin	6,21±0,71	10,76±0,50***	9,43±0,40х
Фосфатидилинозитол/серин Phosphatidyl inositol, serine	14,92±1,03	9,83±0,70***	12,01±0,70х
Фосфатидилхолин Phosphatidyl-choline	14,73±1,16	10,85±0,61**	12,27±0,81
Кардиолипин Cardiolipin	2,48±0,22	1,34±0,18***	1,97±0,22х
Фосфатидилэтаноламин Phosphatidylethanolamine	15,35±0,68	11,03±0,49***	13,81±0,94хх

Примечание. ^** – p<0,01 по сравнению с контрольной группой, ^*** – p<0,001 по сравнению с контрольной группой; ^х – p<0,05 по сравнению с группой «Дисбиоз», ^хх – p<0,01 по сравнению с группой «Дисбиоз».

Note. ** – p<0.01 compared with the control group, *** – p<0.001 compared with the control group;

x – p<0.05 compared with the “Dysbiosis” group, xx – p<0.01 compared with the “Dysbiosis” group.

Исходя из полученных результатов, мы видим, что при воздействии антибиотика произошли значительные изменения в спектре фосфолипидов. Так, количественное содержание ЛФХ и СМ увеличилось в 2,2 и 1,7 раза соответственно по сравнению с показателями контрольной группы. Количество ФИ/ФС и ФХ снизилось в 1,37 и 1,35 раза соответственно. Отмечалось достоверное снижение КЛ в 2,1 раза и ФЭ в 1,39 раза по сравнению с контрольной группой.

При коррекции гентамицинассоцииро-ванного дисбиоза комплексным препаратом «Бифидум БАГ» наблюдалась достоверная

нормализация некоторых показателей фосфолипидного спектра. Так, количество ЛФХ и СМ снизилось в 1,4 и 1,1 раза соответственно по сравнению с показателями группы «Дисбиоз», но показатели контроля достигнуты не были. Отмечалось достоверное повышение содержания ФИ/ФС в 1,2 раза, КЛ – в 1,5 раза, ФЭ – в 1,3 раза по сравнению с показателями группы «Дисбиоз». Изменения ФХ были недостоверны.

В исследовании также были изучены количественные показатели нейтральных липидов (табл. 2).

Таблица 2

Table 2

Количественные характеристики мембранных нейтральных липидов эритроцитов крови мышей в условиях экспериментального дисбиоза и его коррекции препаратом «Бифидум БАГ»

Quantitative characteristics of membrane neutral lipids of blood erythrocytes in mice under experimental dysbiosis and its correction with Bifidum BAG

Нейтральные липиды (M±m) Neutral Lipid (M±m)	Контроль (интактные мыши) Control (intact mice)	Дисбиоз Dysbiosis	Коррекция «Бифидум БАГ» Correction with Bifidum BAG
Холестерол Cholesterol	46,78±1,03	54,26±1,21***	51,36±0,87
Моноацилглицеролы Monoacylglycerol	3,02±0,19	3,78±0,14**	3,27±0,14х
Диацилглицеролы Diacylglycerol	2,28±0,19	2,81±0,11*	2,34±0,16х
Свободные жирные кислоты Free fatty acids	1,79±0,18	1,25±0,15*	1,83±0,21х
Триацилглицеролы Triacylglycerol	5,86±0,55	9,36±0,56***	7,52±0,48х
Эфиры холестерола Cholesteryl ether	28,6±2,63	38,54±2,84*	29,74±1,61х

Примечание. ^* – p<0,05 по сравнению с контрольной группой, ^** – p<0,01 по сравнению с контрольной группой, ^*** – p<0,001 по сравнению с контрольной группой, ^х – p<0,05 по сравнению с группой «Дисбиоз».

Note. * – p<0.05 compared with the control group, ** – p<0.01 compared with the control group, ***

–

p<0.001 compared with the control group, x – p<0.05 compared with the “Dysbiosis”.

Из представленных в таблице данных видно, что количество ХС и МГ увеличилось в 1,15 и 1,25 раза, ТГ и ЭХС – в 1,59 и 1,34 раза соответственно по сравнению с показателями контроля. Содержание СЖК снизилось в 1,43 раза.

При коррекции комплексным препаратом «Бифидум БАГ» отмечались следующие изменения в спектре нейтральных липидов. Так, количество МГ и ДГ снизилось в 1,2 раза, ТГ и ЭХ – в 1,3 раза по сравнению с показателями группы «Дисбиоз». Отмечалось достоверное повышение содержания СЖК в 1,5 раза по сравнению с показателем группы «Дисбиоз». Следует отметить, что все исследуемые показатели достигли уровня контрольной группы. Изменение количества ХЛ было недостоверным.

Заключение. Применение антибиотика широкого спектра действия (гентамицина)

привело к значительному изменению количественного состава нейтральных липидов и фосфолипидов. Снижение количества ФЭ и ФХ может приводить к ослаблению антиоксидантных свойств эритроцитов, так как именно эти фосфолипидные компоненты обладают свойствами ингибирования перекисного окисления липидов [16].

Одним из явных показателей деструкции клеточной мембраны является увеличение количества ЛФХ. Именно это вещество обладает способностью разрыхлять гидрофобную оболочку липидного слоя мембран эритроцитов [17].

Накопление ФИ/ФС может свидетельствовать о повышении адаптационно-компенсаторных механизмов в структуре клеточной мембраны [6]. Тот факт, что СМ не подвергается действию фосфолипаз и, возможно, заме-

щает ФХ, может говорить о сохранении целостности мембран эритроцитов [18].

Из представленных нами данных видно, что при введении антибиотика произошли изменения и в структуре нейтральных липидов эритроцитов. Увеличение содержания ХС и ЭХС может приводить к изменению соотношения щелочной фосфотазы и фосфотидилхо-лина, что значительно меняет строение мембраны [19]. Таким образом, нормальное функционирование эритроцитарной мембраны зависит от ее микровязкости, которая определяется в основном билипидным слоем и зависит от степени интенсификации ПОЛ, накопления насыщенных жирных кислот, холестерола, ионов Ca и Mg, так как при увеличении их

внутриэритроцитарной концентрации снижается электростатический заряд, АТФ и содержание воды внутри клеток [20].

Для коррекции патологических состояний использовали комплексный препарат «Бифи-дум БАГ», в состав которого, помимо живых антагонистически активных видов бифидобактерий B. bifidum и B. longum, входит растительный антиоксидант – дигидрокверцетин. Введение комплексного пробиотика привело к нормализации изменений в спектре большинства исследуемых липидов, что может быть связано с выраженными антиоксидантными, мембраностабилизирующим и антиги-поксическим действием препарата.