Особенности макрофагальной инфильтрации почек у пациентов с инфарктом миокарда



Наличие кардиоренального синдрома (КРС) осложняет течение постинфарктного периода в 40% случаев [1, 2] и служит барьером для улучшения прогноза и снижения смертности у пациентов с инфарктом миокарда (ИМ) [3].

Известно, что развитие постинфарктного ремоделирования сердца связано с активацией системы врожденного иммунитета в ответ на острую ишемию миокарда и гибель кардиомиоцитов [4]. В ответ на повреждение миокарда запускается воспалительная реакция с привлечением клеток иммунной системы – моноцитов/макрофагов (мф) [5]. Поступившие в миокард с током крови моноциты поляризуются в мф с провоспалительным фенотипом (М1 типа), начинается фаза воспаления, которая с 3-х сут ИМ сменяется фазой регенерации, основными участниками которой являются мф с противовоспалительным фенотипом (М2 типа) [6, 7]. Существуют экспериментальные данные, указывающие на наличие кардиоренальных и ренокардиальных взаимоотношений, что проявляется изменением макрофагального состава почки в провоспа-лительном направлении в ответ на ишемию миокарда и поляризацию воспалительных мф сердца. При этом имеются данные об обратной связи, отражающие тот факт, что провоспалительная поляризация мф почки в ответ на ишемию миокарда и/или повреждение почки индуцирует или усугубляет провоспалительную реакцию мф сердца, нарушает контролируемое привлечение и скоординированный переход воспаления в заживление, что в конечном итоге приводит к затяжной воспалительной реакции, характеризующейся неблагоприятным прогнозом [7–9]. Однако данное утверждение не подкреплено результатами in vivo у человека и требует дальнейшего изучения.

Цель исследования: определение фенотипического состава макрофагальной инфильтрации почек и его взаимосвязи с клинико-анамнестическими данными у пациентов, умерших в разные сроки после ИМ.

Материал и методы

В нашей работе в качестве объекта исследования выступали фрагменты почек, полученные во время аутопсии у пациентов ( n = 30), умерших от ИМ I типа в период с 2013 по 2014 гг. Критерии исключения: ИМ II–V типов, онкологические заболевания, инфекционные осложнения (сепсис, пневмония), клапанные пороки, требующие хирургического вмешательства. Исследование проводилось в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и было одобрено локальным этическим комитетом (выписка из протокола № 128 от 23.12.2014 г.). Патологоанатомическое вскрытие осуществлялось согласно приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации от 6 июня 2013 г. № 354н. Подписание информированного согласия пациентов не проводилось, что не противоречило правилам исследования согласно Хельсинкской декларации («Информированное согласие», пункт 32).

Аутопсия выполнялась в течение 24 ч после смерти пациента на базе патологоанатомического отделения. Забранный материал фиксировался в 10% забуферен-ном формалине в течение суток, после чего проводилась стандартная гистологическая проводка и заливка в парафин в аппарате Thermo Scientific Excelsior ES. Парафиновые блоки хранились в архиве в течение 6 лет. Затем из них с помощью ротационного микротома Thermo Scientific HM355S были выполнены микротомные срезы почки с последующим нанесением материала на стекла с L-по-лилизиновым покрытием.

Макрофагальная инфильтрация почек была оценена с помощью иммуногистохимического исследования. С целью иммунофенотипирования мф использовали антитела к общему маркеру мф CD68, антитела к маркеру мф М1 типа CD80 и антитела к маркерам мф М2 типа – CD163, CD206, стабилин-1. Применялась система визуализации HRP-DAB (horseradishperoxidase-3,3’-diaminobenzidine, пероксидаза-3, 3’диаминобензидин). Подсчет мф в почке проводился в светлом поле двумя независимыми специалистами на микроскопе Axio Imager M2, Zeiss. Согласно срокам наступления летального исхода после ИМ пациенты были разделены на две группы: 1-я группа — умершие в течение первых 3 сут от начала заболевания, 2-я группа — умершие в срок с 4-х по 21-е сут.

Обработка данных осуществлялась с использованием статистического пакета STATISTICA 12.0. Нормальность количественных данных проверялась по критерию Шапиро – Уилка. Возраст пациентов и уровень креатинина при поступлении в стационар описывались средним значением (М) и стандартным отклонением ( SD ), остальные количественные показатели, не имевшие нормального распределения, – медианой (Ме) и интерквартильным интервалом ( Q ₁; Q ₃). Категориальные показатели описывались частотами и процентами. Для сравнения количественных показателей в независимых группах использовался критерий Манна – Уитни, для сравнения категориальных признаков – χ² (критерий Пирсона) и точный критерий Фишера. Корреляционные связи между количеством клеток и клинико-анамнестическими данными выявлялись с помощью коэффициента корреляции Спирмена. Проверка статистических гипотез проводилась по уровню значимости р = 0,05.

Результаты

Основные клинико-анамнестические данные пациентов представлены в таблице 1.

Результаты иммуногистохимического анализа макрофагальной инфильтрации почек у пациентов, умерших от ИМ, представлены на рисунке 1. Данные об изменении количества клеток в зависимости от сроков ИМ указаны в таблице 2.

Согласно полученным данным, в почках пациентов, умерших от ИМ, присутствовали как мф М2, так и мф М1 типа. При этом количество CD163+ и CD68+ клеток в раннюю фазу ИМ было значимо выше, чем клеток с иными фенотипами ( p = 0,0001), наименьшим было количество стаби-лин-1+ клеток ( p = 0,001). В позднюю фазу ИМ количество CD68+ клеток стало значимо меньше, чем CD163+ клеток ( p = 0,001), однако оставалось выше, чем количество клеток с иными фенотипами, которые, в свою очередь, количественно друг от друга не отличались (см. табл. 2, рис. 1).

Количество CD206+ клеток ( p = 0,0001) в почках, как и количество CD80+ клеток, снижалось относительно раннего периода ИМ к позднему периоду ( p = 0,001) (см. табл. 2).

Основные корреляционные связи между количеством клеток макрофагального ряда в почках и клинико-анамнестическими данными представлены на рисунке 2.

Наиболее часто с развитием неблагоприятных сердечно-сосудистых осложнений у пациентов с ИМ ассоциировалось количество СD80+ и СD206+ клеток: низкий уровень СD206+ клеток в раннюю фазу ИМ был ассоциирован с высоким риском разрыва стенки ЛЖ.

Таблица 1. Клинико-анамнестические характеристики пациентов, включенных в исследование

Table 1. Clinical and medical history characteristics of patients enrolled in the study

Параметры Characteristics	Все пациенты All patients	1-я группа Group 1	2-я группа Group 2
Количество пациентов, n (%) Number of patients, n (%)	30 (100)	17 (57)	13 (43)
Возраст, лет Age, years	74,8 ± 9,8	73 ± 9,3	77 ± 10,1
Мужской пол, n (%) Male gender, n (%)	12 (39)	7 (42)	5 (38)
ИМспST, n (%) STEMI, n (%)	26 (87)	16 (94)	10 (77)

Локализация инфаркта MI localization

Передний ИМ, n (%) Anterior MI, n (%)	10 (33)	8 (47)	2 (15)
Задний ИМ, n (%) Posterior MI, n (%)	8 (27)	3 (18)	5 (38)
Циркулярный, n (%) Anterior-inferior MI, n (%)	12 (40)	6 (35)	6 (46)

Факторы риска ИБС Risk factors for CAD

СД, n (%) Diabetes mellitus, n (%)	9 (30)	4 (23)	5 (38)
ГБ, n (%) History of hypertension, n (%)	30 (100)	17 (100)	13 (100)
Ожирение, n (%) Obesity, n (%)	10 (33)	6 (35)	4 (31)
Дислипидемия, n (%) Dyslipidemia, n (%)	8 (27%)	2 (12)	6 (46)*
Курение, n (%) Smoking history, n (%)	5 (17)	2 (12)	3 (23)

Наличие в анамнезе Medical history

НРС, n (%) Arrhythmias, n (%)	5 (17)	0	5 (38)
Повторный ИМ, n (%) Recurrent MI, n (%)	16 (53)	7 (42)	9 (69)
ХСН, n (%) CHF, n (%)	15 (50)	6 (35)	9 (69)
ХОБЛ, n (%) COPD, n (%)	11 (37)	7 (42)	4 (31)
МКБ, n (%) Kidney stone disease, n (%)	4 (13)	1 (6)	3 (23)
ХБП на момент госпитализации, n (%) CKD at the time of hospitalization, n (%)	10 (33)	3 (18)	7 (54)*
Уровень креатинина на момент госпитализации, мкмоль/л Creatinine level at the time of hospitalization, μmol/L	115,1 ± 79	150 ± 80,5	155,4 ± 7 9
СКФ на момент госпитализации, мл/мин/1,73м2 Glomerular filtration rate at the time of hospitalization, mL/min/1.73 m2	44 ± 26	48 ± 18	42 ± 30

Поражение коронарного русла, стенозы более 70% Angiography data, lesions > 70%

Ствол ЛКА, n (%) Left main disease, n (%)	3 (10)	0	3 (23)
ПНА, n (%) LAD, n (%)	16 (53)	7 (42)	9 (69)
ОА, n (%) LCX, n (%)	14 (47)	6 (35)	8 (61)
ПКА, n (%) RCA, n (%)	13 (43)	8 (47)	5 (38)

Осложнения ИМ Complications following MI

ОСН при поступлении (> I ФК), n (%) AHF at admission (> I FC), n (%)	22 (73)	15 (88)	7 (54)*
Аневризма ЛЖ, n (%) LV aneurysm, n (%)	7 (23)	4 (23)	3 (23)
Рецидив ИМ, n (%) Recurrent MI, n (%)	8 (27)	1 (6)	7 (54)*
Постинфарктная стенокардия, n (%) Postinfarction angina, n (%)	9 (30)	1 (6)	7 (54)*

Окончание табл. 1

End of table 1

Причина смерти Cause of death

Кардиогенный шок, n (%) Cardiogenic shock, n (%)	25 (86)	12 (70)	13 (100)*
Разрыв миокарда, n (%) Cardiac rupture, n (%)	2 (7)	2 (28)	0
Аритмогенный шок (ФЖ), n (%) Arrhythmogenic shock (VF), n (%)	2 (7)	1 (6)	1 (8)

Примечание: * – статистически значимые различия между группами.

Аббревиатуры: ИМспST – инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST, ИМ – инфаркт миокарда, ИБС – ишемическая болезнь сердца, СД – сахарный диабет, ГБ – гипертоническая болезнь, НРС – нарушение ритма сердца, ХСН – хроническая сердечная недостаточность, ХОБЛ – хроническая обструктивная болезнь легких, МКБ – мочекаменная болезнь, ХБП – хроническая болезнь почек, СКФ – скорость клубочковой фильтрации, ЛКА – левая коронарная артерия, ПНА – передняя нисходящая артерия, ОА – огибающая артерия, ПКА – правая коронарная артерия, ОСН – острая сердечная недостаточность, ФК – функциональный класс, ЛЖ – левый желудочек, ФЖ – фибрилляция желудочков.

Note: * – statistically significant differences between groups.

Abbreviations: STEMI – ST-segment elevation myocardial infarction, MI – myocardial infarction, CAD – coronary artery disease, CHF –chronic heart failure, COPD – chronical obstructive pulmonary disease, CKD – chronical kidney disease, LAD – left anterior descending artery, LCX – left circumflex artery, RCA – right coronary artery, AHF – acute heart failure, FC – functional class, LV – left ventricular, VF – ventricular fibrillation.

Рис. 1. Структура фенотипического разнообразия макрофагальной инфильтрации почек у пациентов, умерших от инфаркта миокарда, в зависимости от сроков наступления фатального инфаркта миокарда: а – ранний период, b – отдаленный период)

Примечание: * – статистически значимое отличие относительно количества клеток CD163+, ** – относительно количества клеток CD68+, *** – относительно количества клеток CD206+, **** – относительно количества клеток CD80+.

Fig. 1. Phenotypic diversity of macrophage infiltration of the kidneys in patients with myocardial infarction and fatal outcome, depending on the timing of the infarction: a – early period, b – long-term period

Note: * – statistically significant difference relative to the number of CD163+ cells, ** – relative to the number of CD68+ cells, *** – relative to the number of CD206+ cells, **** – relative to the number of CD80+ cells.

Рис. 2. Корреляции между количеством клеток макрофагального ряда и клинико-анамнестическими данными у пациентов, умерших от инфаркта миокарда

Примечание: –– связи между количеством клеток и параметром в общей выборке, – – – для 1-й группы, ------для 2-й группы, ИМ – инфаркт миокарда, ИСКА – инфаркт-связанная коронарная артерия, ЛЖ – левый желудочек, ЛКА – левая коронарная артерия, МКБ – мочекаменная болезнь, ОСН – острая сердечная недостаточность, СД – сахарный диабет, ХБП – хроническая болезнь почек, ХСН – хроническая сердечная недостаточность.

Fig. 2. Correlations between macrophage counts and clinical data in patients with MI and fatal outcome

Note: Relationships between cell counts and parameters over the entire patient sample (–––), group 1 (- - -), and group 2 (-----). Abbreviations: AHF – acute heart failure, CHF – chronic heart failure, CKD – chronic kidney disease, DM – diabetes mellitus, IRKA – infarction-related coronary artery, KSD – kidney stone disease, LV – left ventricle, LCA – left coronary artery, MI – myocardial infarction, STEMI – ST-segment elevation myocardial infarction.

Таблица 2. Сравнение фенотипов почечных макрофагов у пациентов, умерших в разные сроки после инфаркта миокарда

Table 2. Comparison of renal macrophage phenotypes in patients died at different times after MI

Параметры клетки Сells	Все пациенты All patients	1-я группа Group 1	2-я группа Group 2
CD 163+	55,5 (28; 47)	55 (27; 55)	58 (25; 57)
CD 206+	4,0 (6,5; 11)	6 (7,5; 15)	2 (0,9; 2)*
CD 68+	30,0 (23; 40)	30 (27; 56)	35 (13; 30)
CD 80+	3 (1,6; 2,7)	5 (1,3; 2,8)	2 (1,2; 2,7)*
Стабилин-1 Stabilin-1+	2 (1,2; 2,1)	1,5 (1,2; 2,6)	2 (1; 2,5)

Примечание: * – статистически значимые различия между группами.

Note: * – statistically significant differences between groups.

Значительное количество СD80+ и СD206+ клеток было связано с большей частотой развития острой сердечной недостаточности (СН) и более ранним сроком наступления летального исхода ( p < 0,05). Также стоит обратить внимание на наличие прямой взаимосвязи между количеством стабилин-1+ и CD163+ клеток и частотой развития аневризмы ЛЖ (см. рис. 2).

Количество CD163+ и CD80+ клеток связано с наличием в анамнезе сердечно-сосудистой патологии: так, высокий уровень СD163+ клеток был ассоциирован с большей частотой встречаемости в анамнезе хронической СН, а большее количество СD80+ клеток было связано с наличием у пациентов в анамнезе повторного ИМ. Количество CD163+, CD80+, CD206+ и стабилин-1+ клеток было связано с наличием в анамнезе патологии почек: так, высокий уровень СD163+ клеток был ассоциирован с наличием в анамнезе МКБ, а меньшее количество СD80+, CD206+ и стабилин-1+ клеток – с наличием в анамнезе ХБП. Количество CD68+ и CD80+ клеток было связано с тяжестью поражения коронарного русла: так, меньшее количество СD80+ и большее количество СD68+ клеток было связано с преимущественным поражением ствола ЛКА. Большее количество СD68+ клеток помимо этого было связано и с большей частотой развития ИМспST (см. рис. 2).

Обсуждение

Основная парадигма взаимоотношений «сердце – почка», базирующаяся на активации ренин-ангиотензи-новой системы (РААС) с последующим повреждением паренхимы почек, повышением артериального давления и развитием гипертрофии миокарда, продемонстрировала свою состоятельность уже несколько десятилетий назад [7, 10, 11]. Отличные результаты показало и применение нейрогормональной терапии, направленной на подавление активации РААС, у пациентов с СН [12]. Однако пределы ее возможностей, вероятно, были достигнуты, ведь несмотря на применение современной терапии ИМ в полном объеме, включающей в том числе и ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента, антагонисты рецепторов ангиотензина II, у 40% пациентов, перенесших ИМ, функция почек к моменту выписки из стационара так и не нормализуется [1, 2].

Не так давно в условиях эксперимента на животных было выявлено участие системы врожденного иммунитета в развитии как СН, так и почечной недостаточности

(ПН) [7, 13–15]. Изменения макрофагальной инфильтрации почек влияли как на изменение макрофагальной инфильтрации сердца, так и на исход заболевания. Стоит отметить, что ранее уже предпринимались попытки изучения особенностей макрофагальной инфильтрации почек и ее динамики, связи с клинико-анамнестическими данными у отдельных групп пациентов – с ХБП, гломерулосклерозом, нефропатией, СД 2-го типа [15]. Однако результаты этих исследований немногочисленны и неоднозначны. Ясно одно, что при различных повреждениях почек одни и те же фенотипы мф могут вести себя по-разному, проявляя как профибротический, так и проти-вофибротический эффект [16]. В случае с ишемическим повреждением почки при ИМ также остается неясным, какой из этих эффектов связан с благоприятным исходом.

В нашу выборку были включены пациенты преимущественно с ИМспST, наиболее частой причиной смерти служил кардиогенный шок. Анализируемые нами группы пациентов были сопоставимы по основным клинико-анамнестическим данным, однако по количеству рецидивов ИМ и постинфарктной стенокардии они отличались, что, вероятно, обусловлено разными сроками наступления летального исхода. Согласно полученным нами результатам, ХБП реже встречалась у пациентов с более ранним сроком наступления летального исхода. Возможно, это обусловлено тем, что в острый период ИМ наличие острой СН, являющейся триггером для развития КРС, чаще регистрировалось у этой группы пациентов. В нашем исследовании при анализе мф инфильтрации почек мы опирались на классическую схему деления мф на два основных фенотипа: М1 и М2 типа – про- и противовоспалительные [4]. Понимая, что мф M1 и M2 типа представляют две крайности спектра с континуумом промежуточных фенотипов между ними, нами была предпринята попытка оценить целый спектр маркеров почечных мф у пациентов с ИМ.

Нами было выявлено присутствие в тканях почек у больных ИМ мф как 1-го, так и 2-го фенотипов в ранние и отдаленные сроки ИМ. Известно, что макрофагальный состав почки в норме представлен в основном тканевыми мф, обладающими противовоспалительным фенотипом (М2) и осуществляющими функцию фагоцитоза и поддержания гомеостаза [17]. При истощении пула тканевых мф в результате ИМ происходит их пополнение пришлыми мф. В условиях эксперимента на животных выявлено, что в ходе острой почечной травмы в ответ на повреждение тканевые мф почек под влиянием молекулярных паттернов, связанных с повреждением и патоген-ассоциированных молекулярных паттернов, реализуют функцию фагоцитоза и активно секретируют провоспалительные цитокины [18], после чего в поврежденную ткань почек рекрутируются естественные клетки-киллеры, нейтрофилы и воспалительные моноциты [15]. Воспалительные моноциты поляризуются в мф M1 типа при участии провоспалитель-ных медиаторов (интерферон-g), запускается процесс воспаления [4], после чего активизируются Th2-клетки и регуляторные Т-клетки, происходит секреция цитокинов интерлейкинов-4 и -10, мф М1 типа поляризуются до M2 фенотипа – происходит разрешение воспаления и восстановление тканей – наступает фаза регенерации [15]. Как было сказано ранее, мф почек могут пополняться как из моноцитов кровотока, так и из эмбриональных предшественников [19]. В нашем случае наличие прямой связи между количеством CD80+ клеток и уровнем циркулирующих в крови моноцитов может отражать эти данные. Преимущественная инфильтрация почек СD68+ и СD163+ клетками в течение всего раннего периода наблюдения и последующее преобладание СD163+ клеток в позднюю фазу ИМ может указывать на тот факт, что CD163+ клетки представляют собой пул тканевых мф, а CD68+ клетки – пул пришлых мф, рекрутированных в почечную ткань в связи с ее острым повреждением.

Известно, что при двухфазной реакции в тканях в ответ на ишемию фаза воспаления сменяется фазой регенерации с преобладанием мф М2 типа и снижением мф М1 типа [4, 7]. Однако в нашей выборке происходит снижение как CD80+ (М1 тип), так и CD206+ (М2 тип) клеток уже к 4-м сут ИМ, что, вероятно, ассоциировано с замедлением пролиферации канальцевых клеток и регенерации почек [15]. Этот факт может указывать и на недостаточную регенерацию/заживление миокарда и ассоциирован с неблагоприятным прогнозом у пациентов с ИМ [20]. Наряду с этим стоит отметить, что значимое снижение CD80+ клеток в регенераторную фазу отражает естественное течение воспалительной реакции после ИМ [4, 19]. Количество СD80+ и СD206+ клеток наиболее часто связано с развитием неблагоприятных сердечно-сосудистых осложнений, таких как высокий риск разрыва стенки ЛЖ, острая СН и скорое наступление летального исхода, что отражает участие клеток данных фенотипов в процессах развития ремоделирования миокарда и прогрессирования СН у пациентов с ИМ. Наличие обратной связи между количеством СD80+, CD206+ клеток и частотой развития ХБП, скорее всего, отражает участие данных клеток в процессах ее развития у пациентов с ИМ. Интересным представляется и тот факт, что наряду с большим количеством CD68+ клеток, количество CD80+ клеток было связано с тяжестью поражения коронарного русла, что также отражает участие активации системы врожденного иммунитета в процессах развития СН [4]. Однако, несмотря на активную вовлеченность CD80+ клеток в процессы развития СН и ПН, в условиях эксперимента отмечено повышение мф М1 типа в воспалительную фазу за счет поляризации тканевых мф почки и пополнения пула мф пришлыми моноцитами [15]. В нашей же выборке подобные данные не выявлены, что также может быть ассоциировано с неблагоприятным прогнозом. У мышей в условиях эксперимента подавление активности экспрессии генов, ответственных за секрецию белков S100A8 и S100A9, участвующих в процессе поляризации мф М2 типа в мф М1 типа в раннюю фазу ИМ путем экс- прессии фактора некроза опухоли почечными мф и индуцирования секреции колониестимулирующего фактора эндотелием подоцитов, ведет к снижению адаптивного ответа миокарда и развитию его гипертрофии и фиброза в ответ на гемодинамическую перегрузку [7, 21]. Повышение концентрации колониестимулирующего фактора в плазме индуцирует пролиферацию мф Ly6Clo в сердце мыши, аналога мф человека типа М2, которая посредством секреции амфирегулина запускает гипертрофический паракринный путь в сердце и поляризацию мф М1 типа в М2 тип в тканях сердца и почек. У этих мышей отмечается дилатация полостей сердца и увеличение смертности в течение 28 сут после ИМ по сравнению с мышами с активной экспрессией генов [7].

Кроме того, нами был проанализирован новый перспективный маркер мф М2 типа – стабилин-1+. Количество стабилин-1+ клеток при ИМ в нашей выборке не снижалось в течение всего периода наблюдения и было минимальным относительно прочих маркеров мф. Ранее было показано, что рецепторы стабилина-1 регулируют миграцию Т- и В-лимфоцитов и гранулоцитов в очаг повреждения и обладают противовоспалительной активностью, препятствуя развитию фиброза при хроническом воспалении [22]. Однако литературные данные относительно роли этого маркера весьма неоднозначны; исследования, посвященные роли рецептора стабилин-1 при поражениях почек, единичны [22]. В нашей выборке зарегистрировано наличие ассоциаций между большим количеством стабилин-1+ клеток и высокой частотой развития аневризмы ЛЖ, наряду с количеством CD163+ клеток. Также выявлено наличие обратной связи между количеством этих клеток в ранний период ИМ и наличием ХБП в анамнезе, что может указывать на участие клеток с данным фенотипом в процессах регенерации как почек, так и миокарда.

Заключение

Макрофагальная инфильтрации почек характеризуется выраженной гетерогенностью в зависимости от сроков смерти после ИМ. В ранние сроки инфаркта преобладают CD163+ и CD68+ клетки, в поздние сроки – CD163+ клетки. Меняется число CD80+ и CD206+ клеток, снижаясь с 4-х сут ИМ. Наличие множественных корреляционных связей между количеством клеток макрофагального ряда в почках и развитием неблагоприятных сердечно-сосудистых осложнений у пациентов с ИМ актуализирует дальнейшее изучение данного направления.