Особенности метаболических процессов в костной ткани при использовании композитных имплантатов из пористого титана с алмазоподобным нанопокрытием

ВВЕДЕНИЕ

В выполненных ранее исследованиях показано, что модификация поверхности титана алмазоподобными пленками (а-С), имеющими структурные особенности в виде пирамидальных выступов, создает лучшие условия для адгезии прилипающих клеток костного мозга, их пролиферации и дифференцировки в остеогенном направлении. Реализация их функциональных возможностей зависит от характера протекания метаболических и синтетиче- ских процессов [2].

Цель исследования – изучить активность ферментов костной ткани при внедрении в искусственно созданную костную нишу насыщенных аутогенными прилипающими клетками костного мозга пористых титановых имплантатов, а также пористых титановых имплантатов с алмазоподобными покрытиями (а-С).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент выполнен на 26 половозрелых 6-10 месячных кроликах массой 2,5-3 кг стадного разведения. В эксперименте использовали два типа имплантатов – ПТi и ПТi (а-С). 1 группу составили 12 кроликов с ПТi (24 имплантата, насыщенных аутологичными клетками костного мозга), 2 группу – 12 кроликов с ПТi(а-С) (24 имплантата, насыщенных аутологичными клетками костного мозга), группа сравнения – 8 образцов из аналогичных областей костной ткани интактных кроликов. Костный мозг кроликов получали пункцией из крыла подвздошной кости. Миелокариоциты однократно отмывали избытком полной культуральной среды. После центрифугирования удаляли супернатант с жировым костным мозгом. Доводили кле- точность суспензии до 5-6×106/мл живых клеток. Имплантаты насыщали прилипающей фракцией клеток аутологичного костного мозга кроликов, внося в лунку стерильных 24-луночных планшетов (SplLifeSciences) с имплантатом (5-6)×106 миелока-риоцитов/мл на 2 часа. Количество клеток увеличивали инкубацией имплантатов с клетками в порах в полной культуральной среде в течение 14 суток при 37 °С, 4 % содержании СО2, абсолютной влажности. Смену 60 % среды осуществляли два раза в неделю. Операции1 по внедрению насыщенных клетками имплантатов кроликам проводили под об- щим наркозом. Выделяли костную площадку, сверлом 4 мм формировали дефект с проникновением в костномозговой канал, вход в него раззенковывали сверлом 4,5 мм. С помощью импактора в метадиафиз устанавливали имплантат таким образом, чтобы поверхность торца имплантата сравнялась с плоскостью кости. Положение имплантата контролировали рентгенологически. Через 5-6 часов животные наступали на оперированную конечность. Через 4, 16 и 52 недели после операции животных выводили из эксперимента. Для оценки активности ферментов остеогенных клеток из костей кроликов вырезали костные блоки 15-20 мм высотой, непосредственно прилегающие к внедренному имплантату, помещали в жидкий азот. Дальнейшие манипуляции проводили на льду. Для разделения цитоплазматической и митохондриальной фракций осуществляли дифференциальное центрифугирование при 0/+4 °С на рефрижераторной высокоскоростной центрифуге Sorval. Изучали активность тартратрезистентной кислой фосфатазы (КФтарт), активность термолабильной щелочной фосфатазы (ЩФтерм), активность малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Исследования выполнены на биохимическом анализаторе Sapphire 400. Полученные результаты пересчитывали на 1 г ткани. Статистическая обработка результатов выполнена с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни с применением программы Statistica Six SigmaRelease 7.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При внедрении в дефект костной ткани пористых титановых имплантатов мы выявили рост активности костного изофермента щелочной фосфатазы в течение 4-16 недель после операции. При использовании ПTi (a-C) изменения были значимыми по сравнению с интактной костной тканью (соответственно 242,3 % р = 0,02 и 156 %, р = 0,01). Данный показатель отражал функцию остеобластов и свидетельствовал об активации процесса остеогенеаза. Активность тартратрезистентной кислой фосфатазы в течение 4-16 недель после операции не претерпевала значимых изменений в группе с ПТi (а-С) и значимо возрастала в группе с ПТi по сравнению с активностью данного фермента в интактной костной ткани. Возможно, это связано с выявленными при гистологических исследованиях ограниченными небольшими областями некроза костного вещества на краевых участках материнского ложа при использовании ПТi имплантатов на ранних сроках наблюдения и отсутствием очагов некроза при использовании имплантатов с модифицированной алмазоподобной пленкой поверхностью. Фосфатаз-ный индекс (ФИ = ЩФтерм/КФтарт) (ПТi (а-С)) достигал максимального значения уже через 4 недели после операции (352 %, р = 0,048), а в группе с ПТi через 16 недель (400 %, р = 0,03). Полученные результаты согласуются с данными гистологических исследований. Покрытие поверхности титановых имплантатов алмазоподобными пленками приводит к активации процесса остеогенеза, что проявляется восстановлением кортикальной пластинки в зоне сформированного дефекта, уменьшением проявления рарификации и дистрофических изменений в материнском ложе от средне выраженных (ПТi) до незначительных (ПТi (a-C)).

Малатдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.37) является полифункциональным ферментным комплексом, участвующим как в синтетических процессах, так и в энергетическом обмене. По современным представлениям, в клетках животных МДГ представлена в димерной и тетрамерной формах. Установлено, что для ткани с активно протекающими аэробными процессами характерно увеличение активности цитоплазматической фракции МДГ, восстанавливающей с помощью НАДН2оксалацетат в малат [1]. Интенсификация анаэробных процессов в тканях характеризуется увеличением глюконеогенеза и снижением активности цитоплазматической МДГ

• [4 ]. Общая активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) связана с экспрессией ее двух полипептидных субъединиц, обозначаемых как "М" и "Н". Субъединицы М-типа ЛДГ функционируют в тканях преимущественно в анаэробных условиях, Н-типа – в хорошо аэрируемых тканях, что объясняется различной стимуляцией их специфической активности, определяемой концентрацией пирувата – низкой в хорошо аэрируемых тканях и высокой – в анаэробных условиях [5]. Данные свойства цитоплазматических МДГ и ЛДГ послужили основанием исследовать их активность для оценки преимущественно аэробной или анаэробной направленности метаболизма в различных тканях [1]. Полученные данные характеризуют активность МДГ в цитоплазме клеток гомогенатов интактной костной ткани, равной 23,7±9,1 МЕ/г ткани, что указывает на меньшую, но значимую активность аэробных процессов в костной ткани по сравнению с клетками интактной печени (49,08 МЕ/г сырой массы) [3]. Соответствие уровня активности цМДГ в костной ткани у группы ПTi (a-C) уровню ее активности в интактной кости с одновременным уменьшением общей активности ЛДГ в цитоплазме по сравнению с интактной костной тканью через 4 недели эксперимента указывает, на наш взгляд, на более выраженное протекание аэробных процессов в конечности с имплантатом ПTi (a-C), по сравнению с ПTi группой, у которой была отмечена тенденция к снижению активности цМДГ и цЛДГ. Аэробная направленность обмена в костной ткани конечности с внедренными ПТi (а-С) имплантатами подтверждается значимым отличием (р = 0,033) соотношения активностей цитоплазматических ЛДГ и МДГ по сравнению с группой с пористыми титановыми имплантатами и по сравнению с интактной костной тканью (р = 0,001). Через 16 недель после внедрения ПТi(а-С) в прилегающей к имплантату костной ткани активность цМДГ выше, а активность цЛДГ ниже, чем в интактной костной ткани. У группы ПТi в эти сроки также отмечается тенденция к росту активности цМДГ, но не достигающей уровня, регистрируемого в интактной костной ткани, и сниженный уровень цЛДГ по сравнению как с интактной костной тканью (р = 0,046), так и с группой ПТi (а-С) (р = 0,025), что мы расцениваем как следствие усиления процессов аэробного окисления в костной ткани обеих групп опытных животных. Через 12 месяцев уровень значимых

отличий в активности цМДГ и цЛДГ у животных с ПТi и ПТi (а-С) по сравнению с интактной костной тканью не выявлено. Однако обращает на себя внимание сохраняющаяся тенденция к снижению активности цЛДГ в обеих группах животных с введенными имплантатами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенный эксперимент показал, что остеоинтеграция пористых титановых имплантатов сопровождалась значимыми изменениями обмена в костной ткани. Характер изменений метаболических реакций зависел от типа применяемого имплантата. Особенностями остеоинтеграции при использовании ПTi (a-C) является более ранняя активация остеогенеза по сравнению с применением

ПTi, на что указывает более ранняя и выраженная активация костной фракции щелочной фосфатазы, увеличение фосфатазного индекса у первой группы животных по сравнению со второй. Одним из механизмов, обеспечивающих возрастающие потребностей костной ткани в макроэргах, является активация метаболизма, характеризуемая увеличением доли аэробного окисления.