Особенности микробного пейзажа при разных типах перипротезной инфекции тазобедренного сустава

При стабильном росте количества выполняемых в мире операций первичного тотального эндопротезирования крупных суставов актуальной становиться проблема ликвидации осложнений, в первую очередь перипротезной инфекции (ППИ) [1, 2, 3]. Диагностика ППИ является сложной задачей. Идентификация соответствующих патогенов важна и является основой для целевого применения антибактериальных препаратов [4]. Традиционно возбудителей инфекции идентифицируют путем микробиологического исследования (МБИ) синовиальной жидкости и тканевых интраоперационных биоптатов. Тем не менее, отсутствие роста микроорганизмов при культивировании достигает 40 % по разным причинам:

• —    формирование биопленок;

• —    образование инертных патогенов;

• —    идентификация возбудителей в неподходящей питательной среде;

• —    применение до верификации возбудителя антибиотиков;

• —    колонизация остеоцитарно-лакунарно-канальцевой сети кортикальной кости [5];

Рост возбудителей ППИ, устойчивых к антимикробным препаратам, значительно усложняет и затягивает процесс лечения. К таким патогенам относятся штаммы стафилококков, резистентные к препаратам трех и более классов, фторхинолон-резистентные и карбапенем-резистентные грамо-трицательные микроорганизмы, грибковая микрофлора [6, 7, 8].

Всё вышеуказанное способствуют формированию хронической инфекции, в ряде случаев со стертыми клиническими проявлениями. Это затрудняет диагностику и определяет значительную долю неудач при лечении пациентов с ортопедической инфекцией [6, 9].

Цель работы — выявить особенности микробного пейзажа при разных типах перипротезной инфекции тазобедренного сустава.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования . Проведен ретроспективный анализ результатов МБИ пунктатов и тканевых интраоперационных биоптатов от 96 пациентов с ППИ тазобедренного сустава (МКБ-10: Z96.6), проходивших лечение с 2015 по 2020 гг. в гнойном хирургическом отделении Свердловского областного клинического психоневрологического госпиталя для ветеранов войн.

Критерии включения : пациенты с клинико-лабораторными признаками ППИ, которым в условиях стационара выполнен о оперативное лечение.

Критерии невключения : пациенты без признаков ППИ.

Исследование одобрено локальным этическим комитетом Госпиталя ветеранов войн (Екатеринбург, протокол от 09.11.2015 г., No 9.2/2015) и проведено в соответствии с Хельсинской декларацией 1975 г. (пересмотр в 2008 г.). Все пациенты подписали информированное согласие на исследование. Детализирующая информация, способствующая персонификации включенных в исследование пациентов, отсутствует.

В соответствии с классификацией глубокой инфекции после полной артропластики тазобедренного сустава (Coventry – Fitzgerald – Tsukayama, [10]) исследуемые разделены на две группы. В группу 1 вошли 16 пациентов с ранней формой ППИ, соответствующей I типу по классификации Tsukayama. В группу 2 включено 80 (83,3 %) пациентов с хронической ППИ, среди которых 39 случаев (48,75 %) составили тип II и 41 случай (51,25 %) — тип III. В наше исследование не вошли пациенты с IV типом ППИ.

В большинстве случаев пациентам группы 1 выполняли процедуру DAIR ( англ .: Debridement, Antibiotics, and Implant Retention). В группу 1 также включены больные с обширными костно-мышечными дефектами после предшествующих оперативных вмешательств и тяжелым соматическим состоянием, выполнение ревизионного эндопротезирования у которых не представлялось возможным. Таким больным выполняли резекционную артропластику тазобедренного сустава и удаление компонентов эндопротеза.

Пациентам группы 2 выполняли двухэтапное ревизионное эндопротезирование тазобедренного сустава.

Исследуемые группы были сопоставимы по поло-возрастным характеристикам ( p > 0,05) (табл. 1). Анализ показал отсутствие статистически значимых различий между группами ранней ( n = 16) и хронической ППИ ( n = 80). При стратификации по возрасту < 65 лет и ≥ 65 лет также не выявлено статистически значимых различий ( p = 0,059).

Таблица 1

Поло-возрастные характеристики пациентов

Параметры сравнения		Группа 1	Группа 2	P -value
		Ранняя ППИ ( n = 16)	Хроническая ППИ ( n = 80)
Мужчины	абс.	10	42	0,464
	%	62,5	52,5
Женщины	абс.	6	38
	%	37,5	47,5
Возраст, лет (M ± SD)		63,7 ± 11,1	57,9 ± 12,2	0,656
< 65 лет	абс.	8	59	0,059
	%	50,0	73,8
≥ 65 лет	абс.	8	21
	%	50,0	26,2

Гнойно-воспалительные осложнения после предшествующих ревизионных вмешательств возникли у восьми (50 %) пациентов группы 1 и у 41 (51,3 %) пациента группы 2.

В 41 (83,7 %) случае из 49 ревизионных вмешательств на предыдущих этапах лечения во время МБИ в тканевых биоптатах был обнаружен патоген.

После первого этапа двухэтапного ревизионного эндопротезирования у пациентов группы 2 рецидив инфекции возник в семи (8,8 %) случаях. Рецидив инфекции после выполнения процедуры DAIR отмечен у одного (6,25 %) пациента группы 1.

У 15 (18,75 %) пациентов группы 2 на I этапе ревизионного эндопротезирования использовали метод NPWT ( англ .: negative-pressure wound therapy), что связано с выраженным гнойным расплавлением мягких тканей, некрозами и склеротическими изменениями костной ткани [11–14]. В данной группе пациентов выявили один (6,7 %) случай рецидива ППИ.

При поступлении в стационар у всех больных собирали жалобы и анамнестические данные, выполняли общий и местный осмотр, выявляли местные признаки воспаления. Для выявления нестабильности имплантов и патологических изменений прилежащих костных структур всем пациентам выполнены рентгенологические исследования пораженных суставов, а при наличии наружных свищей, — рентге-нофистулография [1, 5].

Лабораторные исследования включали определение количества лейкоцитов, показателей СОЭ и С-реактивного белка крови и ее сыворотки [15, 16]. Для бактериологического и цитологического исследования пунктата выполняли диагностическую пункцию перипротезной полости вне зависимости от наличия свищевого хода [17, 18].

Микробиологическое (культуральное) исследование

Исследовали биоматериал, полученный при помощи диагностической пункции перипротезной полости, и интраоперационные тканевые биоптаты. Биоптаты перед посевом гомогенизировали. Биоматериал собирали в стерильный контейнер в соответствии с рекомендациями по забору проб и в течение двух часов доставляли в лабораторию.

После вортексирования 10 мкл пункционной жидкости с помощью стерильной калиброванной петли высевали на питательные среды методом истощающего посева.

Посев производили на питательные среды:

• —    5 % агар c кровью барана (основа Колумбийский агар, Bio-Rad, Франция; кровь барана дефибриниро-ванная, E&O Laboratories, Шотландия),

• —    шоколадный агар (основа Колумбийский агар, Bio-Rad, Франция; кровь барана дефибринированная, E&O Laboratories, Шотландия),

• —    желточно-солевой агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов ГРМ-агар, ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия),

• —    агар Сабуро с 2 % глюкозы и хлорамфениколом (SIFIN diagnostics, Германия).

Для обогащения и выделения анаэробов 100 мкл пункционной жидкости засевали в тиогликолевую среду в пробирках с высоким столбиком (ФБУН ГНЦ ПМБ, Россия). Затем засеянные чашки Петри помещали в термостат с аэробными условиями при температуре (37 ± 1) ° С, чашки с кровяным и шоколадным агаром инкубировали в атмосфере, содержащей 5 % CO 2 . Посевы инкубировали до 72 часов, с оценкой роста через 24, 48, 72 часа.

Идентификацию выросших колоний производили фенотипическими методами (окраска по Граму, тесты на оксидазу, каталазу и др.) и с помощью бактериологического анализатора WalkAway 40 Plus (Beckman Coulter, США).

Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом по стандартной методике, описанной EUCAST, а также с использованием бактериологического анализатора WalkAway 40 Plus (Beckman Coulter, США).

Интерпретацию категорий чувствительности осуществляли по актуальным критериям EUCAST: Clinical breakpoints — bacteria .

Статистический анализ проводили с применением программного обеспечения Jamovi (версия 2.6.17, Австралия) и Microsoft Excel (версия 16.75.2, США). Для описания количественных данных с нормальным распределением использовали среднее значение и стандартное отклонение (М ± SD), для отличных от нормального — медиану и межквартильный интервал (МКИ), соответствующий нижнему (Q1) и верхнему (Q3) квартилям. Проверку нормальности распределения данных проводили с помощью критерия Шапиро – Уилка. Категориальные данные описывали с указанием абсолютных значений и процентных долей ( n , %). Сравнение групп по количественному показателю с нормальным распределением данных выполняли с помощью t-тест Стьюдента или критерия Манна – Уитни U при распределении, отличном от нормального. Для оценки различий между группами по категориальным признакам составляли таблицы сопряжённости 2 × 2. В случаях, когда ожидаемая частота в ячейках превышала 5, использовался критерий χ ² Пирсона. При наличии малых ожидаемых частот (< 5) применяли точный критерий Фишера. Статистическую значимость различий между группами принимали при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ клинических проявлений перипротезной инфекции при поступлении в стационар (табл. 2) показал высокую частоту свищей и ран, которые выявляли у 93,8 % пациентов группы 1 с ранней ППИ и у 80,0 % пациентов группы 2 с хронической ППИ. Гиперемия кожных покровов в области поражённого сустава зарегистрирована в 87,5 % случаев в группе 1 и в 67,5 % случаев в группе 2. Болевой синдром в оперированном суставе отмечен у большинства пациентов обеих групп. Повышение температуры тела до фебрильных значений встречалось относительно редко. Статистически значимых различий по данным клиническим проявлениям между группами не выявлено ( p > 0,05).

Таблица 2

Частота выявления диагностически значимых клинических проявлений ППИ при поступлении в стационар

Клинические проявления	Группа 1		Группа 2		P -value Точный тест Фишера
	Ранняя ППИ ( n = 16)		Хроническая ППИ ( n = 80)
	абс.	%	абс.	%
Свищи/раны	15	93,8	64	80,0	0,289
Гиперемия кожных покровов в области пораженного сустава	14	87,5	54	67,5	0,139
Болевой синдром в оперированном суставе	13	81,3	71	88,8	0,415
Повышение температуры тела до фибрильных значений	2	12,5	18	22,5	0,510

Рецидив ППИ после I этапа отмечен у семи (8,8 %) пациентов группы 2. II этап ревизионного эндопротезирования ТБС выполнен 64 (80 %) пациентам.

Одному пациенту с I типом ППИ в группе 1 после DAIR выполнили двухэтапное ревизионное эндопротезирование, давшее положительным результат.

Два и более сопутствующих заболевания (сахарный диабет, системные заболевания, ожирение, ВИЧ-инфекция, гепатиты В и С, инъекционная наркомания и др.), являющихся факторами риска развития ППИ [1], отмечали в девяти (56,3 %) случаях в группе 1 и в 58 (72,5 %) наблюдениях в группе 2.

Анализ лабораторных показателей воспалительной активности при поступлении (табл. 3) выявил отсутствие статистически значимых различий между группами ( p > 0,05). Среднее количество лейкоцитов было выше в группе ранней ППИ ( p = 0,298). Уровень СОЭ также был выше в группе 1, но различия не достигли статистической значимости ( p = 0,130). Концентрация С-реактивного белка имела тенденцию к более высоким значениям при ранней ППИ ( p = 0,055).

В МБИ 96 пациентов с ППИ получено 103 микробных изолята, из них 16 (15,5 %) — грамотрицательные микроорганизмы и 87 (84,5 %) — грамположительные (табл. 4, рис. 1, 2).

Таблица 3

Лабораторные показатели воспалительной активности у пациентов с ранней и хронической перипротезной инфекцией

Показатели	Группа 1	Группа 2	P -value
	Ранняя ППИ ( n = 16)	Хроническая ППИ ( n = 80)
Количество лейкоцитов, 109/л	7,85 ± 1,97	7,30 ± 2,60	0,298
СОЭ, мм/час	41,25 ± 20,20	30,68 ± 18,65	0,130
С-реактивный белок, мг/л	115,63 ± 44,73	74,97 ± 55,94	0,055

Таблица 4

Структура микробного пейзажа в изолятах исследуемых групп

Возбудитель/группа	Группа 1		Группа 2		Всего ( n = 103)
	Ранняя ППИ ( n = 17)		Хроническая ППИ ( n = 86)
	абс.	%	абс.	%	абс.	%
Грамположительные микроорганизмы	11	64,7	76	88,4	87	84,5
Staphylococcus аureus	7	41,2	39	45,3	46	44,7
Staphylococcus epidermidis	1	5,9	16	18,6	17	16,5
Enterococcus faecalis	1	5,9	7	8,1	8	7,8
Другие КНС**	2	11,8	12	13,9	14	13,6
Грамотрицательные микрооранизмы	6*	35,3*	10*	11,6*	16	15,5
Enterobacter сloacae	4	23,5	2	2,3	6	5,8
Pseudomonas aeruginosa	1	5,9	2	2,3	3	2,9
Другие Грам– возбудители***	1	5,9	6	7,0	7	6,8

Примечание : * — различия между группами статистически значимы ( χ ² = 6,06; Критерий Пирсона p = 0,014); ** — в категорию «Другие коагулазонегативные стафилококки (КНС)» включены: Staphylococcus hominis , S. capitis , S. warneri , S. intermedius ; *** — в категорию «Другие Грам– возбудители» включены: Escherichia coli , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Proteus mirabilis .

Анализ микробного пейзажа по изолятам (табл. 4) выявил статистически значимые различия между ранней и хронической перипротезной инфекцией тазобедренного сустава ( χ ² = 6,06; p = 0,014). В группе ранней ППИ ( n = 17 изолятов) грамотрицательные микроорганизмы были выделены в 35,3 % случаях, тогда как при хронической форме ( n = 86 изолятов) — лишь в 11,6 % случаях. Напротив, грамположи-тельная флора преобладала при хронической ГППИ.

Среди грамположительных бактерий MRSA ( англ .: methicillin-resistant staphylococcus aureus ), MRSE ( англ .: methicillin-resistant staphylococcus epidermidis ), MRSH ( англ .: methicillin-resistant staphylococcus hominis ) встречали в 18 (20,7 %) изолятах (два изолята (11,1 %) — в группе 1, 16 (88,9 %) — в группе 2). В структуре грамотрицательных бактерий БЛРС+ встречали в 16 (25 %) исследованиях (два (12,5 %) — в группе 1, 14 (87,5 %) — в группе 2 соответственно).

Микробные ассоциации обнаружены в 20 (19,4 %) случаях из общего числа микроорганизмов ( n = 103): ассоциации из бактерий Гр(+) и Гр(–) встречали в семи (35 %) случаях; Гр(+) ассоциации — в 10 (50 %); Гр(–) — в трех (15 %) случаях. Обнаружены четыре (20 %) ассоциации, имеющие в составе три и более возбудителя.

У 16 (16,7 %) пациентов обеих групп, несмотря на клинико-лабораторную картину ППИ, результаты МБИ дали отрицательный результат.

Рецидивы ППИ у пациентов с микробными ассоциациями отмечали в трех (15 %) случаях из 20. Рецидив зарегистрирован у четырех (25 %) пациентов с культурально-негативной инфекцией (КНИ).

На рис 3. показана сравнительная оценка микробного пейзажа возбудителей 1 и 2 групп.

Рис. 3. Микробный пейзаж возбудителей ранней (I тип) и хронической (II–III тип) форм ППИ, %

Анализ микробного пейзажа среди пациентов также показал достоверные различия в распределении возбудителей ранней и хронической перипротезной инфекцией ( χ ² = 8,94, p = 0,003). В группе ранней ППИ ( n = 16) грамотрицательную флору выявили в 31,3 % случаев ( n = 5), что существенно чаще по сравнению с хронической ГППИ ( n = 80), где грамотрицательные микроорганизмы встречали лишь в 9,2 % случаев ( n = 7). Напротив, грамположительная флора преобладала при хронической инфекции — 92 % ( n = 74) против 50 % ( n = 8) случаев при ранней форме.

Полученные данные подтверждают, что гра-мотрицательные микроорганизмы оказыва- ют значимое влияние на развитие ранних форм перипротезной инфекции, в то время как хронический вариант заболевания преимущественно ассоциирован с грамположительной флорой.

Среди пациентов группы 2, которым на I этапе ревизионного эндопротезирования применяли NPWT ( n = 15), в интраоперационных МБИ встречали только грамположительную флору. Всего в этой группе получено 12 микробных изолята, в трех случаях (20 %) — КНИ. Ассоциации получены в одном (6,7 %) случае, MRSA/MRSE — в трех (20 %) случаях.

Среди пациентов с ревизионными вмешательствами на предшествующих этапах лечения ( n = 49) у 12 (24,5 %) обнаружены микробные ассоциации (четыре (33,3 %) — в группе 1, восемь (66,7 %) — в группе 2). У трех (25 %) из них отмечали рецидив ППИ, в дальнейшем двоим повторно выполнили дебридмент с заменой цементного спейсера. Рецидив инфекции отмечали у четырех (25 %) пациентов с КНИ в группе 2.

ОБСУЖДЕНИЕ

Анализируя микробный пейзаж, можно отметить лидирующую долю грамположительной флоры в причинах развития ППИ (в группе 1 — 50 %, в группе 2 — 92 %) [6, 19–22]. Рост грамотрицательной флоры при ранних формах ППИ значительно превышал аналогичные показатели хронических форм инфекции: 31,3 % и 9,2 % соответственно. Данные микроорганизмы представляют серьезную проблему для всех ортопедов, занимающихся первичным и ревизионным эндопротезированием, ввиду неуклонно возрастающей резистентности микрофлоры ко многим антибактериальным препаратам [23]. Вовлечение грамотрицательных бактерий в этиологию ППИ усложняет и пролонгирует процесс лечения [24]. Эффективность применения методики DAIR в таких условиях может значительно снижаться.

Частота встречаемости P. aeruginosa при ранней форме ППИ — 6,3 %, при хронической форме — 2,3 %. P. aeruginosa может являться причиной развития ранней/послеоперационной внутрибольничной инфекций [25]. По данным различных авторов, P. aeruginosa является причиной внутрибольничной инфекции более чем в 15 % случаев [26–28].

Проблемой в лечении пациентов с ППИ являются микробные ассоциации. В нашем исследовании частота встречаемости полимикробных инфекций при I типе ППИ составила 25 %, при II–III типах ППИ — 18,4 %. Микробные ассоциации усложняют выбор этиотропной антибиотикотерапии, что часто приводит к худшим исходам лечения в сравнении с мономикробной микрофлорой [29, 30].

При хронических формах ППИ в 52,9 % случаях выделяется золотистый стафилококк, характеризующийся ростом резистентных штаммов [6, 19–22]. Количества штаммов MRSA/MRSE/MRSH в нашем исследовании были сопоставимы.

Устойчивость к метициллину не является решающим фактором вирулентности, однако метициллин-резистентные штаммы S. aureus (MRSA) часто экспрессируют более высокий уровень факторов вирулентности, которые способствуют их выживанию и распространению [31].

В клинически сложных случаях с выраженной деструкцией мягких тканей мы применяли NPWT на первом этапе ревизионного эндопротезирования [11]. В 83,3 % изолятов данной группы пациентов выделен S. aureus. Поражению тканей способствует несколько существенных особенностей S. aureus, в частности при ППИ. S. aureus способны продуцировать ряд токсинов, включая альфа-токсин, эксфолиативные токсины (ETA, ETB, ETC), энтеротоксины и лейкоцидин Пантона – Валентина. Кроме того, у S. aureus существует множество секретируемых ферментов и белков клеточной стенки, опосредующих инвазию тканей, таких как коагулаза, ДНКаза, гиалуронидаза, коллагеназа и фибронектинсвязы- вающие белки. Большинство факторов вирулентности кодируются дополнительными генами, которые могут присутствовать или отсутствовать у отдельного штамма S. aureus. Также исследования in vitro показывают, что штаммы S. aureus быстро агрегируют в присутствии синовиальной жидкости человека и в течение 24 часов развиваются в макроскопические колонии, которые в конечном итоге преобразовываются в биопленку, устойчивую к антибиотикам [32]. Компоненты синовиальной жидкости, такие как фибриноген, фибронектин и свободная ДНК, могут вызывать агрегацию бактерий, которая, как предполагается, играет роль в патогенезе ППИ.

R. Proctor et al. изучали S. aureus в связи с его частой ассоциацией с инфекциями костей и суставов и хорошо охарактеризованной способностью существовать в квазидремлющем состоянии (так называемый фенотип малых колоний SCV), что потенциально способствует хронизации заболевания [33].

КНИ в нашем исследовании встречали в 25 % случаев в группе 1 и в 16,1 % в группе 2. Это согласуется с мировыми данными, по которым культурально-негативная ППИ встречается от 5 % до 42 % случаев [21, 34–38]. Этот факт часто осложняет выбор антимикробного препарата. В настоящее время рекомендуется при диагностике использовать молекулярные методы, включающие полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенирование. Эти методы продемонстрировали улучшение микробной идентификации при культурально-отрицательной ППИ [37, 38]. Кроме того, часто не выявленные, но присутствующие культуры при традиционном посеве являются результатом нахождения микроорганизмов в состоянии биопленки. Обнаружено, что культивирование пункционной жидкости и удаленных имплантов, обработанных ультразвуком, увеличивает выход микробов за счет разрушения бактериальной биопленки и чувствительность ПЦР [37].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В структуре этиологии ранней ППИ (I тип) преобладали грамотрицательные микроорганизмы и их ассоциации, при хронических формах (II и III тип) — грамположительные патогены. Культурально-негативная инфекция являлась причиной развития ранних форм ППИ чаще, чем хронических (25,0 % и 16,1 % соответственно). Статистически значимых различий между группами по выделению мети-циллинрезистентного стафилококка, а также грамотрицательных бактерий БЛРС+ не выявлено.