Особенности микроциркуляторных реакций в области экспериментального раневого дефекта у белых крыс

¹ Введение. В настоящее время во всем мире распространенность острых и хронических ран остается на высоком уровне. Различные осложнения, которыми может сопровождаться процесс заживления ран, включая раневую инфекцию, формирование гипертрофированных рубцов и келоидов, оказывают негативное влияние как на качество жизни пациентов, так и на экономику системы здравоохранения в связи с увеличением продолжительности и стоимости лечения [1]. Одним из важных этапов создания новых средств для ухода и лечения ран является их апробация in vivo , что обусловливает актуальность совершенствования моделей и средств оценки эффектов инновационных продуктов.

По современным представлениям процесс заживления ран представляет собой сложную сеть физиологических изменений, включая реакции со стороны микрососудов зоны повреждения [2, 3]. Микроцирку-ляторные реакции в области раны оказывают непосредственное влияние на динамику и интенсивность репарации кожных ран, корригируя метаболические фазы течения раневого процесса [4]. Наблюдение за динамикой раневого процесса позволяет принять своевременное эффективное терапевтическое решение, что оказывает значительное влияние на конечный результат лечения.

Сегодня лазерная допплеровская флоуметрия — одна из самых современных неинвазивных методик, позволяющих оценить состояние микроциркулятор-ного русла [5]. Новизной методологического подхода, реализующегося в ходе настоящего исследования, является разработка возможности применения параметров лазерной допплеровской флоуметрии в оценке динамики репаративной регенерации кожных ран .

В связи с этим цель настоящего исследования — выявить изменения параметров микроциркулятор-ного русла методом лазерной допплеровской фло-уметрии в процессе заживления раневого дефекта и возможности их применения для модернизации технологий оценки эффективности средств для лечения ран.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на 25 белых крысах массой 250–320 г, разделенных на две группы: в контрольную группу были включены 10 интактных крыс, в опытную группу вошли 15 животных с полнослойным экспериментальным дефектом кожи.

На протяжении всего эксперимента животные находились в стандартных условиях вивария в индивидуальных клетках. Для общей анестезии животным вводились «Телазол» («ZoetisInc», Испания) в дозе

0,1 мл/кг и «Ксиланит» (ООО «Нита-Фарм», Россия) в дозе 1 мг/кг внутримышечно. Все исследования были выполнены в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (1986), национальных руководств и правил учреждения по содержанию и использованию лабораторных животных и одобрены этическим комитетом Саратовского ГМУ имени В. И. Разумовского (протокол № 1 от 05.02.2019).

Контрольная группа, включавшая 10 интактных крыс, была сформирована для регистрации исходных параметров микроциркуляции кожи у крыс, которым не проводилась обработка антисептиками.

Моделирование полнослойного дефекта кожи осуществлялось хирургическим методом [6]. Для этого у животных опытной группы после депиляции и антисептической обработки кожи в межлопаточной области с помощью квадратного трафарета 5%-м йодом наносились контуры будущего раневого дефекта. По разметке с помощью скальпеля проводилось формирование полнослойного раневого дефекта размером 10×10 мм.

Для исследования состояния микрокровотока в зоне раневого дефекта использовали метод лазерной допплеровской флоуметрии, реализация которой выполнялась с помощью прибора «ЛАКК-ОП» (Россия). Измерение параметров микроциркуляции у животных опытной группы проводили на 14-е сутки эксперимента, располагая датчик анализатора на расстоянии 1 мм от верхнего края экспериментального дефекта. Оценивали перфузионный показатель и нормированные амплитуды эндотелиальных, нейрогенных, миогенных, дыхательных и сердечных колебаний [7].

Вывод животных из эксперимента осуществлялся передозировкой препаратов для наркоза. Для оценки морфологических изменений, происходящих в зоне экспериментальной полнослойной раны, мягкие ткани раневого дефекта забирались на 14-е сутки эксперимента и фиксировались в 10%-ном растворе формалина для дальнейшего гистологического исследования. Гистологические срезы толщиной 5 мкм окрашивались гематоксилином и эозином (ООО «Биовитрум», Россия). Микроскопию препаратов зоны раневого дефекта выполняли с помощью микровизора проходящего света серии μVizo-103 (ООО «ЛОМО ФОТОНИКА», Россия). Оценивали состояние и кровенаполнение сосудов микроциркуля-торного русла, а также инфильтрацию дна раны и ее перифокальной зоны клеточными элементами, участвующими в реализации раневого процесса, такими как фибробласты, лимфоциты, макрофаги.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 10.

Изменение показателей микроциркуляции в зоне раневого дефекта, Ме (Q₂₅; Q₇₅)

Показатели	Группа
	контроля ( n =10)	опытная ( n =15)
Показатель перфузии, перф. ед.	10,4 (9,6; 12,3)	13,2 (11,3; 14,1) р =0,015
Амплитуда колебаний, усл. ед.
эндотелиальных	15,2 (11,5; 17,7)	5,3 (4,04; 6,1) р <0,001
нейрогенных	6,8 (6,7; 8,2)	6,7 (5,4; 7,5) р =0,157
миогенных	6,7 (5,9; 7,9)	10,6 (7,3; 11,6) р <0,001
дыхательных	9,1 (7,9; 11,6)	14,7 (12,5; 18,8) р <0,001
сердечных	3,8 (3,3; 4,7)	18,6 (16,4; 20,1) р <0,001

П р и м еч а н и е : в каждом случае приведены медиана и интерквартильный размах; p — по сравнению с контролем.

А                        Б                          В                         Г

Морфологические изменения в зоне раневого дефекта (окраска гематоксилином и эозином): А — зона раневого дефекта кожи (объектив ×5); Б — полнокровие сосудов перифокальной зоны, лимфоцитарная инфильтрация (объектив ×20); В — сладж и сепарация крови, лимфоцитарная инфильтрация, сидерофаги в перифокальной зоне (объектив ×40); Г — нейтрофильная инфильтрация края раневого дефекта (объектив ×40).

Полученные данные не соответствовали законам нормального распределения, поэтому представлены в таблице в виде медианы ( Ме ) и интерквартильного размаха (Q₂₅; Q₇₅). Сравнение между группами проведено с помощью критерия Манна — Уитни. Критический уровень значений показателя достоверности принимали равным 0,05.

Результаты. На 14-е сутки эксперимента у крыс опытной группы отмечалось уменьшение площади раневого дефекта до 6,3 (5;30) мм² (уменьшение на 95% от исходной величины).

При оценке микроциркуляторных нарушений в зоне полнослойной кожной раны установлено, что у крыс опытной группы на 14-е сутки эксперимента перфузионный показатель кожи на границе раневого дефекта был статистически значимо выше контрольных значений на 27%. Повышение перфузии в данной группе животных сопровождалось перераспределением вклада активных и пассивных механизмов модуляции микрокровотока. При оценке активных механизмов модуляции выявлено статистически значимое снижение нормированных амплитуд эндотелиальных колебаний на 65% относительно контроля и, напротив, увеличение нормированных амплитуд миогенных колебаний на 58%. Значимых изменений нормированных амплитуд нейрогенных колебаний перфузии кожи на границе раневого дефекта у крыс опытной группы через 2 недели не вы- явлено. Установлено, что большой вклад в изменение микроциркуляторных реакций кожи на границе раневого дефекта вносят пассивные механизмы модуляции кровотока. Это проявлялось статистически значимым увеличением относительно контрольных значений нормированных амплитуд дыхательных колебаний на 6l %, а сердечных — в 4,9 раза (таблица).

При морфологическом исследовании препаратов зоны раневого дефекта установлено, что соединительная ткань перифокальной зоны богата кровеносными сосудами артериального и венозного русла (рис. А, Б). Отмечается их полнокровие (рис. Б), в отдельных сосудах присутствует сладж и сепарация крови (рис. В). При анализе клеточных популяций области кожной раны обнаружено, что преобладающей клеточной популяцией являются фибробласты. Наблюдается выраженная лимфоцитарная инфильтрация, присутствуют единичные сидерофаги. Края и дно раны инфильтрированы нейтрофилами (рис. Г).

Обсуждение. Полученные в ходе эксперимента данные о темпах регенерации полнослойной кожной раны согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что раневой дефект кожи у крыс к 14-му дню эксперимента эпителизирует-ся более чем на 90% [8]. Вместе с тем результаты проведенного исследования подтверждают, что заживление кожной раны у крыс опытной группы сопровождается выраженными изменениями микро- кровотока, проявляющимися повышением перфузии краев раневого дефекта, а также изменением вклада активных и пассивных механизмов в регуляции кровотока. Полученный результат соответствует данным других авторов, которые продемонстрировали активацию коллатерального кровотока на модели полнослойного дефекта кожи [3].

Выявленные особенности микроциркуляторных реакций соответствуют морфологическим изменениям, происходящим в области раневого дефекта. Так, повышение перфузии краев кожной раны согласуется с наличием большого количества сосудов по периферии раны. Кроме того, отмечается их выраженное кровенаполнение, что непосредственно приводит к увеличению перфузионного показателя.

Увеличение вклада пассивных механизмов модуляции микрокровотока краев раневого дефекта у крыс опытной группы на 14-е сутки эксперимента, проявляющееся повышением сердечных и дыхательных колебаний в спектре ЛДФ-грамм, характеризует усиление притока и затруднения оттока крови в микроциркуляторном русле соответственно [9]. Это подтверждает визуализированное полнокровие сосудов как артериального, так и венозного русла. Наличие сладжа и сепарации крови в отдельных венулах свидетельствует о резком снижении оттока крови, что, вероятно, является одной из причин выраженного увеличения вклада дыхательных колебаний в модуляцию кровотока в микроциркуляторном русле кожи краев раневого дефекта.

Следует отметить, что эффективное заживление ран и образование грануляционной ткани невозможно без ангиогенеза. Процесс образования новых сосудов в физиологических и патологических условиях регулируется различными биологически активными веществами, среди которых особая роль отводится цитокинам и ростовым факторам. Согласно данным литературы, нейтрофилы, которые первыми мигрирует в область раневого дефекта, способны синтезировать и высвобождать широкий спектр цитокинов и проангиогенных факторов, таких как VEGF, TNFα, IL-1β, IL-8, которые прямо или косвенно способствуют росту и миграции эндотелиальных клеток, что вызывает образование новых кровеносных сосудов [10]. В то же время источниками цитокинов и ростовых факторов, влияющих на ангиогенные реакции, могут быть и другие клетки лейкоцитарного ряда, в частности лимфоциты, а также тканевые макрофаги и пролиферирующие фибробласты [11]. Присутствие в зоне экспериментального раневого дефекта клеток указанных ранее популяций, включая нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты и фибробласты, и продукция ими регуляторных молекул может объяснять выявленные изменения микроциркуляции. В частности, обнаруженное в ходе исследования снижение миогенного тонуса сосудов, сопровождающееся увеличением нормированных амплитуд миогенных колебаний, может быть связано с продукцией различных провоспалительных цитокинов лейкоцитами, присутствующими в тканях зоны раневого дефекта в большом количестве. Помимо этого, в очаге воспаления развивается локальный ацидоз и гипоксия тканей, которые, в свою очередь, приводят к снижению миогенного тонуса и дилатации прекапиллярных сфинктеров, что выражается в увеличении амплитуд миогенных колебаний [9].

Заключение. Особенности микрокровотока в области раневого дефекта, выявленные с помощью лазерной допплеровской флоуметрии, соответствуют морфологическим характеристикам динамики раневого процесса. Мониторинг микроциркуляторных нарушений, возникающих в области кожных ран, позволяет неинвазивно оценить динамику репаративного процесса, что может быть использовано для патогенетической разработки и оценки эффективности существующих и медикаментозных и немедикаментозных методов стимуляции регенерации.