Особенности морфологического строения первичной опухоли при мультицентрическом / мультифокусном росте рака молочной железы

На сегодняшний день при оценке прогноза у пациенток с РМЖ, наряду с такими клинико-морфологическими признаками, как возраст больной, размер опухоли и исходная распространенность процесса, степень гистологической злокачественности, все большее значение придается параметрам, отражающим различные биологические свойства опухолевых клеток [1, 9].

Одними из первых, вошедших в практику и изучаемых до сегодняшнего дня, являются такие характеристики, как рецепторный статус клеток первичной опухоли и гиперэкспрессия онкопротеина Her2/neu. Во многих исследованиях показано более благоприятное течение ре-цепторпозитивных карцином молочной железы в сравнении с опухолями, неэкспрессирующими рецепторы к половым гормонам [1, 7]. Гиперэкспрессию онкобелка Her2/neu при раке молочной железы большинство исследователей связывают с негативным прогнозом, низкой чувствительностью к химиотерапии и более агрессивным течением болезни [4, 7, 10].

В последние десятилетия широко изучаются прогностические данные о пролиферативной активности опухоли, параметрах апоптоза, маркерах, отражающих состояние межклеточной адгезии и цитоскелета злокачественных клеток. Однако прогностическое значение многих из них не всегда является однозначным.

Наряду с характеристиками эпителиального компонента опухоли, особое значение придают параметрам стромы опухоли, в частности, процессу ангиогенеза, выраженности и качественному составу воспалительной инфильтрации в ней [6, 12, 15].

Известно, что у части больных рост новообразования может быть множественным, так называемым мультицен-трическим/мультифокусным. Указанный характер роста рака молочной железы не является редкой патологией. Имеющиеся в литературе данные о частоте встречаемости данного варианта РМЖ весьма вариабельны и колеблются от 3,76 до 58% наблюдений [3, 5, 11]. Однако крайне малочисленны и иногда противоречивы исследования об особенностях морфологического строения первичной опухоли, о характеристиках, отражающих такие ее биологические свойства, как пролиферативная активность, параметры апоптоза, экспрессия маркеров межклеточной адгезии, ростовых факторов у пациенток с множественным ростом РМЖ. Кроме того, отсутствуют данные о состоянии стромального компонента опухоли и состава воспалительной инфильтрации в нем у больных с муль- тицентрическим/мультифокусным ростом новообразования.

Цель исследования: изучение параметров, отражающих основные биологические свойства опухолевых клеток и состояние стромального компонента в первичной опухоли инвазивного протокового РМЖ при мультицен-трическом/мультифокусном характере роста.

Материал и методы

Изучался операционный материал от 511 больных инфильтрирующим РМЖ в стадии T2–4 N0-2 M0, находившихся на лечении в отделении общей онкологии НИИ онкологии СО РАМН с 2000 по 2005 гг. Возраст больных был от 35 до 80 лет, средний возраст составил 52,9±9,6 лет. В предоперационном периоде 380 больным проводились 2–4 курса неоадъювантной химиотерапии по схеме CMF или FAC; 131 пациентке предоперационное лечение не назначалось; 380 больным хирургическое лечение было выполнено в объеме радикальной мастэктомии. В 131 наблюдении проведены органосохраняющие операции (радикальная или секторальная резекция молочной железы с аксиллярной лимфодиссекцией). В послеоперационном периоде 495 пациенток получили адъювантное лечение. В 172 случаях проводились 2–6 курсов химиотерапии по стандартным схемам CMF или FAC, 44 пациента получали гормонотерапию. В 279 случаях проводилось комплексное лечение, в составе которого 220 пациенткам назначалась лучевая терапия. Морфологическому исследованию подвергался операционный материал. Оценивалась ткань первичных опухолевых узлов и все аксиллярные лимфатические узлы. Для выявления муль-тицентрического роста при гистологическом исследовании изучалась ткань молочной железы из четырех квадрантов (при радикальной мастэктомии) и ткань удаленного сектора (при органосохраняющих операциях). Образцы тканей фиксировались в 10-процентном нейтральном формалине. Материал обрабатывался по стандартной методике и заливался в парафин. Срезы толщиной 5–6 мкм окрашивались гематоксилином и эозином. Диагноз рака молочной железы устанавливался согласно Гистологической классификации опухолей молочной железы (ВОЗ, Лион, 2003).

В зависимости от варианта роста опухоли все пациентки были разделены на две группы. В первую группу вошли 441 больная с УР. Вторую группу составили 106 пациенток с мультицентрическим/ мультифокусным ростом опухоли. При этом у 27 пациенток данный тип рос- та РМЖ был диагностирован на дооперационном этапе с помощью клинико-инструментальных методов (мульти-центрический рост, выявленный клинически – МРК). В 79 наблюдениях множественный характер роста обнаружен после гистологического исследования удаленной ткани молочной железы (мультицентрический рост, выявленный гистологически – МРГ).

При исследовании инфильтративного компонента инвазивной протоковой карциномы выделяли тубулярные, трабекулярные, микроальвеолярные, солидные структуры, группы клеток. Указывалось количество структур в инфильтративном компоненте в каждом случае. Степень злокачественности оценивали по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. При этом учитывали количество тубулярных и протоковых структур, число митозов и клеточный полиморфизм.

Воспалительную инфильтрацию в строме первичного опухолевого узла оценивали полуколичественным методом по 3-балльной системе (1 балл – слабо выраженная, 2 балла – умеренно выраженная, 3 балла – резко выраженная).

Выраженность стромы характеризовали по процентному соотношению паренхиматозного и волокнистого компонента, где 1 баллом обозначали слабую выраженность стромы (паренхимы ≥ 70%), 2 баллами – умеренную выраженность стромы (паренхимы <70%, но >10%), 3 баллами обозначали случаи с резко выраженной стромой (паренхимы <10%).

Изучение различных экспрессионных характеристик клеток первичного опухолевого узла и состава воспалительной инфильтрации в нем проводили на парафиновых срезах иммуногистохимическим способом с использованием стрептавидин-биотинового метода. При исследовании применяли антитела фирмы “Dako” к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные), к онкопротеину c-erbB–2, к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные), к CD 3 (клон UCHT1), CD8 (клон C8/144B), CD20 (клон L26), фирмы “Novocastra” к р53 (клон CM1), к bcl2 (клон bcl2/ 100/D5), к Е-кадхерину (клон 36B5), к TGF β (клон TGF β 17), к TGF β R1 (клон 8А11), к CD4 (клон 1F6), к CD 25 (клон 4C9), CD68 (клон 514H12), CD117 (клон T595), к CD 138 (клон 5F7), фирмы “Biogenex” к CD45 LCA (клон PD7/26/16&2B1, RTU, мышиные), фирмы “Diagnostic Biosystem” к α -катенину (поликлональные). Использование каждого вида антител сопровождалось постановкой контрольных реакций на серийных срезах.

Экспрессию р53, Ki67, bcl2, TGF β , TGF β R, Е-кадхери-на, α -катенина оценивали в процентном содержании положительно окрашенных клеток в каждом варианте структур паренхиматозного компонента первичной опухоли. Экспрессию bcl2, TG β F, TGF β R, СD45 LCA, СD3, СD4, СD8, СD68, СD117, СD138, СD20, СD25 в клетках воспалительного инфильтрата оценивали полуколичественно (0 баллов – отсутствие; 1 балл – 1–5 клеток; 2 балла – 6–20 клеток; 3 балла – более 20 клеток) вблизи каждого варианта структур паренхиматозного компонента опухоли (не далее чем на 1–2 диаметра малого лимфоцита) и в строме новообразования в отдалении от паренхиматозных структур.

Оценку плотности микрососудов в строме опухоли проводили на основании экспрессии эндотелиальными клетками CD31. Плотность оценивалась с помощью объект-микрометра по количеству сосудов на 1 мм2.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ STATISTICA 6.0. При анализе полученных данных были применены методы описательной статистики, дисперсионный анализ (среднее значение М, стандартное отклонение σ ). Для расчета достоверности различий применялись непараметрический критерий хи-квадрат, использовался корреляционно-регрессионный анализ по Спирмену (коэффициент ранговой корреляции r), F – критерий Фишера, p – уровень статистической значимости.

Результаты

Инвазивный протоковый рак молочной железы является самой частой гистологической формой рака молочной железы и составляет порядка 80% [14]. В связи с этим особый интерес представляло изучение морфологического строения данной гистологической формы РМЖ при разном характере роста новообразования. Оценка такого морфологического параметра, как степень гистологической злокачественности не показала каких-либо различий в зависимости от варианта роста РМЖ ( χ ²=4,1; p=0,3). Однако наличие тубулярных структур в первичной опухоли, которые являются одним из признаков при оценке степени злокачественности РМЖ, достоверно чаще обнаруживалось в карциномах больных с множественным характером роста ( χ ²=6,5; p=0,002). Интересные данные были получены в отношении микроальвео-лярных структур. Показано, что они значимо чаще выявлялись при мультицентрическом/мультифокусном росте новообразования у больных с сохраненным менструальным циклом ( χ ²=9,5; p=0,008).

Каких-либо значимых различий по частоте встречаемости солидных структур и дискретно расположенных групп опухолевых клеток при разных вариантах роста РМЖ выявлено не было.

Был проведен анализ взаимосвязи между количеством типов структур в инфильтративном компоненте опухоли и характером роста РМЖ. Обнаружено, что при любом варианте мультицентрического рака, в сравнении с уницентрическим РМЖ, опухолевые узлы чаще представлены большим разнообразием инфильтративного компонента и практически не встречаются случаи с одним типом структур в отличие от уницентрического характера роста. Данная зависимость оказалась значимой только для тех больных, у которых менструальный статус был сохранен ( χ ² =13,8; p=0,03).

Поскольку проведение предоперационного лечения может оказывать определенное влияние на морфологические характеристики опухоли, оценка состояния стромального компонента и выраженности воспаления в опухолевом узле проводилась с учетом этого фактора. Так, было выявлено, что у пациенток, не получавших неоадью-вантной химиотерапии и имеющих мультицентричес-кий/мультифокусный рак, строма опухоли была выражена меньше, чем в новообразованиях, при которых рост

Таблица 1

Зависимость размера новообразования от рецепторного статуса опухоли при разных вариантах роста РМЖ

Рецепторный статус опухоли Размер опухолевого узла, см (M±σ) Вариант роста рака молочной железы 1 2 3 УР МРК МРГ РЭ+РП+ РЭ+РП– РЭ–РП– РЭ–РП+ 2,8±1,5 3,1±1,5 3,3±1,8 p1–2=0,23 3,0±1,1 F=1,59; p=0,19 2,7±1,3 2,8±1,4 3,9±1,8 p2–3=0,38 2,7±1,3 F=0,49; p=0,83 2,8±1,9 1,9±0,47 4,26±2,5 p1–3=0,025 2,3±1,1 F=3,0; p=0,035 был уницентрическим (χ2=12,6; p=0,013). Исходя из полученных результатов, можно полагать, что при множественном росте РМЖ в ткани опухоли преобладает паренхиматозный компонент и гораздо реже встречаются случаи, когда он выражен минимально.

Рецепторный статус опухоли является важным параметром, отражающим не только ее потенциальную чувствительность к терапевтическому воздействию, но и сопряженным с особенностями течения заболевания. В связи с этим было весьма интересным оценить данный признак при различных вариантах роста РМЖ. Значимых отличий указанного параметра в зависимости от варианта роста РМЖ не обнаружено. Однако у больных с множественным характером роста новообразования отмечена тенденция к большей частоте случаев опухолей с позитивной экспрессией рецепторов эстрогенов и прогестерона в сравнении с уницентрическим РМЖ (соответственно 54 и 44%; p=0,06). Наиболее значимые различия были выявлены при изучении характера распределения рецепторов половых гормонов в опухоли. Оказалось, что в случаях мультицентрического/мультифокусного рака чаще определялась, преимущественно, гетерогенная экспрессия рецепторов эстрогенов, тогда как гомогенное распределение рецепторов эстрогенов (РЭ), которое рассматривается нами [8] как более благоприятный признак

“функциональное состояние” опухолевых клеток при раке молочной железы, относятся пролиферативная активность, экспрессия клетками ростовых факторов, показатели апоптоза и межклеточной адгезии. В связи с тем, что проведение предоперационного лечения может оказывать определенное влияние на эти признаки, оценку данных параметров при разных вариантах роста РМЖ мы проводили только в опухолях больных, не получавших неоадъювантного лечения (табл. 2).

Как видно из данных, представленных в таблице, различные варианты роста РМЖ не отличались по показателям пролиферативной активности и апоптоза. Однако при множественном опухолевом росте отмечена более выраженная экспрессия клетками маркера межклеточной адгезии Е-кадхерина и низкая экспрессия фактора роста TGF- β с тенденцией к более высокой экспрессии рецепторов к нему.

Поскольку многие из исследованных параметров сопряжены с темпом роста опухоли, была проанализирована связь между данными признаками и размером клинически выявляемого опухолевого узла. Оказалось, что только при мультицентрическом/мультифокусном росте имеется обратная корреляция между величиной опухоли и экспрессией клетками проапоптотического протеина р53 (r=–0,57; р=0,026), чего не наблюдалось при уницентрическом росте новообразования (r=–0,04; р=0,76).

Показатели пролиферативной активности и экспрессия маркера апоптоза bcl-2 в указанных группах не были связаны с величиной опухолевого узла. Параметры, отражающие состояние цитоскелета и межклеточной адгезии, также оказались не взаимосвязанными с размером опухоли как при уницентрическом РМЖ, так и при муль-тилокальном росте. Позитивная экспрессия опухолевыми клетками ростового фактора TGF- β и рецептора к нему не была сопряжена с размером новообразования ни при одном из вариантов роста.

Наряду с экспрессионными характеристиками опухоли, отражающими ее различные свойства, при разных вариантах опухолевого роста был проанализирован стромальный компонент. По результатам нашего исследова- в отношении регионарного метастазирования, чаще выявлен при уницентрическом РМЖ (χ2=10,8; p=0,004).

При разном характере роста РМЖ был проведен

анализ размера опухолевого узла в зависимости от рецепторного статуса. Показано, что только в случаях мультицентрического рака, выявленного при гистологическом исследовании, имеется взаимосвязь между изучаемыми параметрами. Оказалось, что при данном типе роста опухоли наибольший размер новообразования наблюдался при негативной экспрессии РЭ и рецепторов прогестерона (РП) в сравнении со случаями, когда опухоли имели позитивный рецепторный статус (F=3,0; p=0,035), таблица 1. Кроме того, необходимо отметить, что размер рецепторнегативных опухолей (РЭ-РП-) был значимо больше при МРГ в сравнении с уницентричес-ким РМЖ (p1–3=0,025).

Наряду с рецепторным статусом к основным иммуногистохимическим маркерам, отражающим

Таблица 2

Экспрессия показателей пролиферативной активности, апоптоза, межклеточной адгезии, TGFβ и TGFβ-R в инфильтративном компоненте опухолевого узла у больных при разных вариантах роста РМЖ

Показатель,% (M±σ)	Вариант роста рака молочной железы		Параметры
	Уницентрический	Мультицентрический/ мультифокусный
Ki67	7,3±14,1	6,2±5,7	F=0,18; p=0,67
p53	63,6±37,2	59,1±42,2	F=0,1; p=0,74
bcl-2	64,8±34,5	63,3±35,4	F=0,01; p=0,9
α-катенин	62,6±27,5	70,1±30,5	F=0,4; p=0,52
Е-кадхерин	36,5±25,7	60,3±38,1	F=5,1; p=0,028
TGF-β	67,0±36,1	21,3±9,7	F=10,7; p=0,002
Рецептор к TGF-β	23,7±17,1	37,8±26,6	F=2,7; p=0,1

ния были показаны различия в выраженности сосудистой плотности (экспрессия CD31) в опухоли у больных с разным характером роста опухоли. Так, при мультицент-рическом/мультифокусном росте новообразования средний показатель плотности сосудов был выше, чем при уницентрических раках (соответственно 110±38,1 и 81,3±33,9; F=6,6, p=0,01).

Еще одной важной составляющей, характеризующей стромальный компонент опухоли и отражающей эффекторные иммунные реакции в ней, является воспалительная инфильтрация. При разных вариантах роста РМЖ нами оценивалась выраженность и качественный состав воспалительной инфильтрации. Показано, что инфильтрация CD45 LCA+ клетками не имела существенных отличий при уницентрическом и множественном опухолевом росте ( χ ²=0,7; p=0,67). Однако при сравнении качественного состава воспалительного инфильтрата был обнаружен ряд значимых различий. Оказалось, что при мультицентрическом/мультифокусном росте инфильтрация в строме опухоли вдали от инфильтративного компонента СD20+ В-лимфоцитами значимо ниже, чем при уницентрическом РМЖ ( χ ²=16,5; p=0,0008). Так, при уни-центрическом варианте роста опухоли выраженная инфильтрация CD20+В-лимфоцитами отмечена в 40,4% наблюдений, в то время как в опухолях больных с множественным ростом – лишь в 6,7%.

Важно отметить, что ни в одном случае при мульти-локальном РМЖ в воспалительном инфильтрате не было выявлено присутствия тучных клеток (CD117+), которые при уницентрическом росте обнаруживались в 51% опухолей ( χ ²=12,2; p=0,006). По данным некоторых исследователей, присутствие в инфильтрате тучных клеток при РМЖ ассоциировано с благоприятным прогнозом заболевания [13].

Также показаны отличия в выраженности инфильтрации стромы опухоли вдали от инфильтративного компонента субпопуляциями Т-лимфоцитов. Обнаружено, что при мультицентрическом/мультифокусном росте значимо реже встречаются случаи с выраженной инфильтрацией СD8+ лимфоцитами, чем при уницентрическом РМЖ ( χ ²=9,2; p=0,025). Наличие в строме опухоли CD4+ лимфоцитов при уницентрическом росте встречалось в 59,6%, в то время как при множественном росте – только в 26,7% (p=0,016).

Каких-либо отличий в инфильтрации стромы опухоли CD68+ макрофагами ( χ ²=4,2; p=0,2), плазматическими клетками (CD138– χ ²=5,1; p=0,15), а также в экспрессии клетками инфильтрата рецептора к интерлейкину-2 (CD25) при разных вариантах роста РМЖ не было.

Заключение

Проведенное исследование позволило обнаружить ряд существенных отличий в морфологическом строении опухолевых узлов при мультицентрическом/мульти-фокусном росте рака молочной железы. Опухоли при данном варианте роста характеризуются большим морфологическим разнообразием инфильтративного компонента, клетки которого характеризуются более высокой экспрессией маркера межклеточной адгезии (Е-кадхери- на) и низкой экспрессией ростового фактора (TGF-β). Сочетание указанных параметров может являться признаком более благоприятного прогноза заболевания. Кроме этого при мультицентрическом/мультифокусном росте отмечено преобладание паренхиматозного компонента в опухоли, что может быть обусловлено более низкой апоптотической активностью клеток и интенсивным ангиогенезом в строме новообразования. Связь размера опухолевого узла при множественном варианте роста РМЖ с рецепторным статусом более отчетлива в сравнении с уницентрическим. В случаях мультицентрических карцином выявлены различия в качественном составе воспалительного инфильтрата стромы опухолевого узла, проявляющиеся снижением инфильтрации различными иммунокомпетентными клетками, связанными как с гуморальным иммунным ответом, так и с Т-клеточными эффекторными реакциями.