Особенности морфометрической оценки интерстициального фиброза почки крысы в фармакологических исследованиях

Введение. Одной из проблем современной урологии продолжает оставаться поражение паре-химы почки, вызванное обструкцией мочевыводящих путей. При своевременном устранении причин, вызывающих затруднения оттока мочи, незначительные патологические изменения могут иметь благоприятный прогноз. Однако, хроническое течение данного процесса неизбежно приводит к развитию ренального фиброза и, как следствие, к выраженному нарушению экскреторной функции почек. Поэтому одной из актуальных задач нефро-фармакологии является разработка адекватных моделей прогрессирующего нефрофиброза и поиск новых подходов к созданию лекарственных средств (ЛС) антифиброзной направленности. В течение многих лет экспериментальные исследования были сфокусированы на изучении роли гломерулопатологии как основного патогенетического звена в развитии нефрофиброза. Однако клинические исследования неоднократно показывали, что прогрессирование ренальных повреждений в большей мере коррелировало с ренальным интерстициальным фиброзом, чем с патологией клубочков почки [17]. Разработанная позже модель интерстициального фиброза при помощи односторонней обструкции мочеточника (ООМ)[15] позволила изучить действие ЛС на различные патогенетические звенья формирования и прогрессирования этой патологии. Одним из основных способов оценки выраженности патологического процесса является гистологический метод, позволяющий устанавливать морфометрические параметры для сравнительного анализа эффективности ЛС. Для определения степени развития интерстициального фиброза можно использовать количественную оценку площади соединительной ткани с помощью цифровых систем анализа изображений, необходимым условием применения которых является контрастирование интересующего объекта [12,21,22]. Для визуализации компонентов соединительной ткани хорошо воспроизводимых результатов достигают посредством достаточно трудоемких трихромных мето- дов окрашивания гистологических структур: по Маллори, по Масону [21,22] и т. п. Однако некоторые авторы указывают на возможность получения сходных результатов с помощью технически более простого специфического окрашивания соединительной ткани пикросириусом красным [9].

Цель настоящего исследования заключалась в сравнительном анализе двух различных методов окрашивания элементов соединительной ткани (трихромного по Массону и монохромного пикросириусом красным) на основе количественного критерия оценки площади интерстициального фиброза с использованием отечественного программного обеспечения ВидеоТест Морфология 5.2. применительно к фармакологическим доклиническим испытаниям ЛС и подбор адекватной дозы референтного препарата. В качестве референтного препарата нами был протестирован лозартан как представитель группы блокаторов рецепторов 1 типа ангиотензина II (АТ-1 рецептор), обладающих мультифакториаль-ным антифибротическим и нефропротективным потенциалом [8].

Материал и методы. Исследование было проведено на 43 самцах крыс линии Wistar массой 340—390 г (питомник ФИБХ РАН, Пущино). Животных содержали в стандартных условиях вивария при температуре 20°С со свободным доступом к корму и воде. Животные были разделены на 4 группы: 1 контрольную (n = 7) и 3 экспериментальных (n=12 в каждой). Общая анестезия достигалась путем внутрибрюшинного введения смеси 10 % раствора золетила (Zoletil 100, Virbac, France; рег. № ПВИ-2-1.9/01425) и 2 % раствора ксилазина гидрохлорида (Xyla, Interchemie, Holland; рег. № ПВИ-2-4,6/01924) в соотношении 5:1, соответственно, из расчета 0,07 мл/кг. Крыс из экспериментальных групп подвергали односторонней перевязке правого мочеточника на уровне 1- 1,5 см дистальнее ворот почки. Контролем служили ложнооперированные животные (группа 1). Введение соединений начинали на следующий день после операции. В течение 9-ти суток животным из экспериментальных групп ежедневно однократно при помощи зонда вну-трижелудочно вводили следующие растворы: раствор лозартана в 1 % Твин 80 в дозах 10 мг/ кг (группа 3) и 30 мг/кг (группа 4), 1 % водный раствор Твина 80 в том же объеме (группа 2). На 10-е сутки после операции крыс декапитировали. Правую почку каждого животного взвешивали и фиксировали в 10 % нейтральном формалине (Bio Optica, Italy) в течение 24 часов. Фиксированные органы разрезали перпендикулярно продольной оси, начиная с верхнего полюса почки, на образцы толщиной 1 мм при помощи аппарата McIWain Tissue Chopper (The Mickle Laboratory Engineering

Co. LTB). Полученные образцы в течение 24 часов дофиксировали в 10 % нейтральном формалине, после чего из них последовательно с шагом в 2 мм, начиная с 1-го образца, отбирали материал для изготовления гистологических срезов. Отобранный материал дегидратировали, пропитывали парафином автоматически в аппарате закрытого типа (Tissue-Tek VIP 5 Jr, Sakura, Japan) и заливали в парафиновую среду (Histomix, Россия) в полуавтоматическом режиме станции Tissue TEC (Sakura, Japan). Серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм изготавливали на ротационном микротоме (Sakura, Assu-Cut SRM, Japan) и окрашивали тремя способами: гематоксилином Майера и водноспиртовым эозином-Y по традиционной методике; трихромным методом окрашивания по Массону с анилиновым синим (Bio Optica, Italy) согласно протоколу; пикросириусом красным согласно представленной ниже методике. Срезы депарафинировали и окрашивали в течение 60 мин в 0,1 % растворе сириуса красного (растворе 0,1 %) на пикриновой кислоте (рН=2,0), затем на 1—2 сек. опускали в 0,01М солянокислый спирт, дегидратировали в спиртах и заключали в бальзам. Микроскопическое исследование выполняли с помощью светового микроскопа Olympus BX51, оцифровку изображений осуществляли камерой ColorView ХС50 при увеличении х200. Площадь фиброза (%) оценивали по отношению к общей площади поля зрения с помощью программного обеспечения Морфология 5.2 (ВидеоТест, Россия). Выбор полей зрения осуществлялся по заранее установленному алгоритму, не связанному с распределением фиброза в исследуемом образце. Количество анализируемых полей зрения определялось площадью среза и составляло обычно 7—25 на один срез. Число обработанных полей зрения на одно животное составляло 140 — 170. Межгрупповое сравнение результатов производили с использованием непараметрического критерия ANOVA (STATISTICA 6.0).

Результаты исследования и их обсуждение. Обзорный анализ состояния тканей почки крыс на гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, выявил следующую морфологическую картину. У большинства животных группы 1 (контроль) эпителий извитых канальцев почки практически не претерпевал изменений, кровенаполнение капилляров клубочков почечного тельца было умеренным. Только в двух случаях отмечалась мелкоочаговая умеренная отечность эпителия канальцев коркового вещества, а также полнокровие капилляров отдельных клубочков.

У всех животных группы 2, подвергнутых ООМ и получавших плацебо (модель), были обнаружены патоморфологические изменения, харак- терные для картины хронической обструктивной нефропатии (хронического обструктивного пиелонефрита). Так, большинство извитых канальцев почки животных из этой группы атрофировано, а часть канальцев находилась в состоянии дилятации (рис. 1a,1b). Во всех случаях отмечалось ослабление окрашивания кислым красителем (эозин) эпителия большинства канальцев, что указывало на начальный этап некробиоза. Просвет сохранившихся канальцев был значительно сужен из-за выраженной гиперплазии нефроцитов. Капилляры клубочков умеренного кровенаполнения, а незначительное их количество с признаками запустевания. Практически во всех образцах почки отмечено утолщение капсулы клубочков различной степени выраженности (рис. 1a). В субкапсулярной зоне коркового вещества выявлялась выраженная диффузная инфильтрация лимфоци-

Рис. 1. Почка крысы через 10 дней после односторонней перевязки мочеточника. Стрелкой отмечено: (а) утолщение капсулы клубочка, (б). экссудация плазмы и эмиграция форменных элементов крови, Окраска гематоксилином и эозином.Ув. 400

тами, макрофагами и плазматическими клетками, в глубоких зонах почки эти явления носили диффузноочаговый характер. Вокруг атрофированных извитых канальцев отмечался умеренный перитубулярный фиброз (рис. 2а,3б) и незначительные застойные явления в сосудах микро-циркуляторного русла преимущественно на границе коркового и мозгового вещества, экссудация плазмы и эмиграция форменных элементов крови (рис. 1б). В просвете многих канальцев выявлялись изолированные нефро-циты, клеточный детрит и воспалительно-клеточный инфильтрат. При этом такие канальцы были заметно расширены. Выраженность гидронефроза правой почки крыс носила некоторую вариабельность в пределах группы.

У оперированных животных 3 группы, получавших лозартан в дозе 10 мг/ кг, при изучении микроструктур исследуемой почки сохранялись характерные патологические особенности, выявленные во второй группе. Однако выраженность воспалительного процесса в интерсти-ции коркового вещества несколько уменьшилась. Канальцы нефронов почки этих животных также находились преимущественно в состоянии атрофии или выраженной дилятации. У всех животных данной

группы отмечался умеренный интерстициальный фиброз, а в некоторых случаях и мелкоочаговый некроз, утолщение капсулы клубочков почечного тельца. У оперированных животных 4 группы, получавших лозартан в дозе 30 мг/кг, выраженных отличий от микроструктуры почки крыс 3группы не выявлялось. Среди характерных патологических изменений наблюдалась также атрофия и дилятация значительной части канальцев, про- областей фиброза органа и его вычисление с помощью компьютерной программы по предварительно заданному нами цветовому диапазону. При анализе полученных данных при окраске пикросириусом красным, было выявлено, что площадь интерстициальной соединительной ткани почки животных контрольной группы 1 составляет 0,99 ± 0,13 %, а при окраске трихромным способом — 3,47±0,25 %. После наложения лигатуры слеживалась тенденция к уменьшению объема перитубулярного интерстиция за счет торможения воспалительного процесса. Выраженных патологических изменений в почечных тельцах обнаружено не было. При анализе гистологических препаратов, полученных с помощью различных методов окрашивания, было отмечено, что значительный объем соединительной ткани почки всех животных наблюдался преимущественно в периваскулярном пространстве крупных кровеносных сосудов, а также в области мозговых лучей и на месте атрофированного мозгового вещества (рис. 2,3). При использовании нами метода окрашивания гистологических срезов по Массону с анилиновым синим паренхима почки окрашивалась в краснокоричневый цвет, межклеточное вещество соединительной ткани — в светло голубой, а грубые пучки коллагеновых волокон – в синий (Рис. 2), что являлось оценочным критерием при подсчете площади фиброза в почке. При окраске пикросириусом красным сформировавшиеся волокна коллагена окрашивались в ярко-красный цвет на красно- розовом фоне паренхимы почки (Рис.3). Контрастность окрашивания срезов позволяла осуществить автоматическое выделение

Рис. 2. Почка крысы через 10 дней после односторонней перевязки мочеточника.Окраска по Массону. Стрелкой отмечено: (а)перитубу-лярный фиброз, х 400; (б).периваскулярный фиброз,Ув.200

на правый мочеточник у животных, получавших плацебо (группа 2), этот показатель увеличился в 4 раза (4,16 ±0,44 %, р<0,001) при окраске пи-кросириусом красным и в 1,7 раза (5,96±0,15 %, р<0,05) при окраске по Массону. При лечении лозартаном животных 3 и 4 групп, получавших препарат в дозе 10 и 30 мг/кг соответственно, был обнаружен положительный терапевтический эффект (рис.4). Степень выраженности фиброза

Рис. 3. Почка крысы через 10 дней после односторонней перевязки

мочеточника.Окраска пикросириусом красным. Стрелкой отмечено: перитубулярный фиброз в корковом веществе; фиброз в области мозгового луча. Ув. х400 (а ) Ув. 200 (б).

почки была заметно слабее относительно нелеченых крыс группы 2. Однако, особенности выявления структурных компонентов соединительной ткани разными способами окрашивания привели к неоднозначной оценке результата. Так, при контрастировании фиброза пикросириусом красным было выявлено значимое торможение процесса независимо от дозы вещества. Площадь фиброза после лечения лозартаном в дозе 10 и 30 мг/кг снизилась почти в 2 раза и составила 1,91±0,33 % (р<0,001) и 1,76 ± 0,21 % (р<0,001) соответственно. При трихромном способе окрашивания аналогичного значимого действия препарата, примененного в дозе 10 мг/кг, не обнаружилось. Так, при сравнении площади нефрофиброза у животных 2-ой и 3-ей групп наблюдалась некоторая тенденция к уменьшению данного показателя в 3-ей (5,96±0,15 % и 5,06±0,48 % (p = 0,09) соответственно). После лечения животных 4 группы лозартаном в дозе 30 мг/кг количественная оценка фиброза на препаратах, окрашенных по Массону, показала результат, подтверждающий аналогичные данные, полученные с помощью монохромного способа контрастирования. У крыс данной группы отмечалась значимая нормализация показателя площади фиброза относительно нелеченых животных группы 2 (4,38±0,53 % (р<0,01) и 5,96±0,15 %соответствен-но) (рис.4).

Статистически значимого межгруппового отличия при оценке эффективности лечения между группами 3 (лозаратан 10 мг/кг) и 4 (лозартан 30 мг/кг) выявлено не было. Как известно операция унилатерального наложения лигатуры на мочеточник грызунов позволяет смоделировать прогресси- рующий обструктивный интерстициальный фиброз. Он по ряду основных морфофункциональных характеристик сходен с клинической картиной обструктивной нефропатии у человека [5]. Техника перевязки мочеточника отличается своей вариабельностью, что позволяет формировать патологический процесс различной степени выраженности. Полная перевязка мочеточника приводит к нарушению ренального кровотока и клубочковой фильтрации в течение первых суток после операции [19]. Вслед за тем в течение 1-2 недель развивается гидронефроз, формируется воспалительная гистиоцитарная инфильтрация стромы, выраженная дилятация канальцев, апоптоз и некроз тубулярного эпителия [5, 22]. Гибель эпителия канальцев нефрона в этот период происходит в результате большого набора факторов. Основными из них являются механическое сдавление, ишемия, гипоксия и повреждающее действие активных радикалов кислорода. Данный процесс является важным патогенетическим фактором в развитии нефрофиброза. Это проявляется в его ция тубулярного эпителия происходит в результате нарушения межклеточных контактов и адгезивных свойств и приводит к формированию в просвете канальцев клеточных кластеров из погибающих и жизнеспособных клеток. Это затрудняет отток мочи и является дополнительным патогенетическим фактором в развитии нефропатии. Установлено, что формирование воспалительного инфильтрата опосредовано выделением медиаторов воспаления из поврежденных клеток паренхимы почек [3]. Воспалительный процесс в интерстиции почки, а также механическое давление приводит к активации секреторной функции фибробластов стромы [2]. Нарушение адгезии, атрофия, деструкция и гибель части эпителиоцитов канальцев запускает механизм формирования пула миофибробластов de novo из тубулярного эпителия (эпителиально-мезенхимальное пере-рождение)(EMS), а также перицитов, эндотелиальных клеток и клеток костномозгового происхождения. Активированные фибробласты и миофибробласты экспрессируют маркер α-smooth положительной корреляции с прогрессированием процесса. Полученные экспериментальные данные показали, что на 10-день после использованного нами варианта полной односторонней перевязки мочеточника обнаруженные патоморфологические изменения соответствуют картине, наблюдаемой другими авторами через 7-14 дней после проведения аналогичной процедуры [5, 22]. Обзорный анализ гистологических препаратов показал, что во всех группах экспериментальных животных в правой почке развивался выраженный гидронефроз, сопровождавшийся гибелью тубулярных эпителиоцитов, дилятацией сохранившихся канальцев и тубулоинтерстициальным воспалением различной степени выраженности. В просветах многих канальцев был выявлен слущенный эпителий, макрофаги и белковые цилиндры. Как показано в аналогичных исследованиях [6], подобная десквама-

Рис. 4. Морфометрическая оценка площади интерстициального фиброза почки крыс через 10 дней после операции ООМ при контрастировании соединительной ткани монохромным (сириус красный) и трихромным ( по Массону) способами окрашивания. Результаты представлены как М ± м , где М – среднее значение, м – ошибка среднего значения; гр1 – ложнооперированные животные; гр2 - животные с ООМ, получавшие плацебо; гр3– животные с ООМ, получавшие лозартан в дозе 10 мг/кг; гр4 - животные с ООМ, получавшие лозартан в дозе 30 мг/кг; х- группы экспериментальных животных; у – площадь интерстициального фиброза в %; * - Р<0,05; *** - Р<0,001 относительно гр1, ХХ - Р<0,01; ХХХ - Р<0,001 относительно гр2.

muscle actin (α-SMA) и играют ключевую роль в потенцировании фиброгенеза при обструкции мочевыводящих путей, продуцируя различные типы коллагена (в основном, I и III), фибронектин, протеогликаны и другие компоненты экстракле-точного матрикса в интерстиции почки [5]. Важную роль в процессе фиброзирования придают нарушению метаболизма фибронектина, формирующего основу для накопления других белков и являющегося хемоаттрактантом для фибробластов. Среди компонентов экстрацелюллярного матрикса именно депозиция фибронектина в ин-терстиции почки коррелирует с тяжестью структурных повреждений и выраженностью почечной недостаточности [1]. Известно более 30 различных гуморальных факторов, экспресссия которых в той или иной степени увеличивается при обструктивной нефропатии, и более десятка медиаторов эпителиально-мезенхимального перерождения, находящегося в центре внимания современных исследований нефропатии. Среди них ключевая роль в прогрессировании фиброза почки отводится трансформирующему фактору роста β (TGF-β), как основному активатору EMS, и фактору роста гепатоцитов (HGF) как основному ингибитору этого процесса. А также вазоактивным биологически активным соединениям – ангиотен-зиногену, ангиотензину II, эндотелину, тромбоксану А 2 [5]. Все эти факторы в той или иной мере являются точками приложения в поиске новых ЛС противофиброзной направленности. Одним из хорошо изученных веществ, активирующих процессы фиброгенеза, является ангиотензин II – основной вазоактивный пептид ренин-ангиотензиновой системы, являющийся также ключевым медиатором воспаления, индуцирующим экспрессию широкого спектра цитокинов и хемокинов, в том числе TGF-β. Как ингибиторы ангиотензин-конвертирующего фермента, так и блокаторы ангиотензиновых рецепторов 1 типа проявили выраженный нефропротективный потенциал как в экспериментальных исследованиях [8], так и в клинике [4]. Лозартан является лекарственным препаратом с антигипертензивным фармакологическим эффектом, механизм действия которого связан с блокадой ангиотензиновых рецепторов 1 типа. Установлено, что лозартан способен уменьшать выделение альбумина, пролиферацию клеток, инфильтрацию макрофагов и образование коллагена I и IVтипов [14]. Показано, что антифибротический эффект лозартана проявляется независимо от его гемодинамического свойств [7] и связан с прямым супрессирующим действием на ключевые медиаторы фиброгенеза — TGF-β, α-фактор некроза опухолей (TNF-α) и другие [16]. Несмотря на выраженный антифи-бротический эффект блокаторов ангиотензино- вых рецепторов 1 типа, препараты данной группы не способны полностью затормозить процессы фиброгенеза. Поэтому поиск антифибротических химических соединений продолжается, а лозар-тан часто используют в качестве референтного препарата при исследовании фармакологической активности потенциальных терапевтических средств [22]. Терапевтический эффект лозартана в эксперименте достигается при применении достаточно широкого диапазона доз и разных схем его введения в зависимости от целей исследования. При моделировании нефропатий на грызунах наиболее часто используются ежедневные дозы в пределах от 7,5 до 50мг/кг. Выбранные нами терапевтические дозы лозартана – 10 и 30 мг/кг — являются соответствующими ожидаемому антифиброзному эффекту препаратов этого класса в эксперименте. Однако эффективность их использования определилась методическим подходом к решению проблемы морфометрии площади индуцированного обструктивного интерстициального фиброза. Нами показано, что курсовое ежедневное пероральное введение экспериментальным животным в течение 9 дней лозартана в дозах 10 и 30 мг/кг оказывает определенный анти-фиброзный эффект. При обзорном гистологическом анализе срезов почек крыс, подверженных операции перевязки правого мочеточника и получавших лозартан, в большинстве случаев отмечается уменьшение площади интерстиция с участками выраженного воспалительного инфильтрата в корковом веществе правой почки по сравнению с оперированными и получавшими плацебо животными через 10 дней после вмешательства. Однако, дозовой зависимости при использовании данной схемы введения и выбранных доз при обзорном анализе не обнаружено. Для количественной оценки выраженности патологического процесса на гистологических препаратах, окрашенных как рутинными, так и специальными способами, часто применяется балльная система и метод точечного счета с использованием морфометрической сетки [18,22]. Данные методы позволяют получить удовлетворительные результаты при оценке фиброза в случае выраженной диспозиции (локализации) коллагена, что наблюдается при глубоких изменениях микроструктуры органа. Однако в практике фармакологических доклинических исследований наиболее часто моделируют патологический процесс средней выраженности, позволяющий провести адекватный сравнительный анализ активности ЛС. В таких случаях при использовании морфологического критерия оценки развития интерстициального фиброза руководствуются подбором специальных гистологических методов визуализации соединительной ткани и соответствующего программного обеспечения для морфометрии. Обычно необходимого контрастирования структурных компонентов экстраклеточного матрикса добиваются трихромными способами окрашивания по Маллори, по Массону и их модификациями [21,22]. Некоторые авторы отмечают, что широко используемый способ окрашивания соединительной ткани по Маллори применительно к моделированию обструктивной нефропатии с использованием программного обеспечения анализа изображений дает худшие результаты, чем окраска пи-кросириусом красным. Оба этих метода одинаково выявляют коллаген I, III и IV типа при окраске гистологических срезов почки. Однако анилиновый синий, входящий в состав трихромного красителя Маллори, может окрашивать темноголубым цветом не только коллаген, но и белковые отложения внутри проксимальных канальцев, появляющиеся в результате деструкции эпителия и нарушения процессов фильтрации и реабсорбции. Авторы считают, что цифровая система анализа изображений лучше дифференцирует коллагеновые структуры, контрастируемые ярко красным цветом при окраске пикросириусом красным [9]. В отличие от трихромных методов окрашивания, сириус красный проявляет большую тропность к гидроксипролинам коллагена [9] и окрашивает в ярко-красный цвет сформировавшиеся коллагеновые волокна (рис. 3). Соответствующая настройка системы анализа изображений по цветовому диапазону программы ВидеоТест Морфология 5.2 позволяет произвести автоматический подсчет площади интерстициального фиброза почки крыс при обоих способах окрашивания. Однако на препаратах, окрашенных по Массону, средняя площадь фиброза (%) заметно превышала аналогичный показатель, полученный в тех же условиях при окраске пикроси-риусом красным (5,96 % и 4,16 % соответственно). Аналогичные результаты получены [11], использующими для морфометрии цифровую систему анализа изображений KS400 (Carl Zeiss Vision GmbH, Hallbergmoos, Germany). По данным других авторов, использующих трихромные методы окрашивания, площадь интерстиция, затронутого процессами фиброгенеза на 7-14 день после оперативной обструкции мочевыводящих путей занимала от 13 до 20 %[21,22]. Возможности более широкого диапазона визуализации при окраске по Массону связаны, по-видимому, с контрастированием в сине-голубом цветовом диапазоне помимо коллагена таких компонентов межклеточного вещества как протеогликаны. Согласно полученным нами данным на гистологических препаратах, окрашенных пикросириусом красным, лозартан проявляет антифиброзную активность как в дозе 10 мг/кг, так и в дозе 30 мг/кг, одинаково значимо снижая показатель площади интерстициального фиброза относительно нелеченых животных примерно в 2 раза (табл.1). Однако на препаратах, окрашенных по Массону, удалось выявить зависимость терапевтического эффекта лозартана от применяемой дозы. Так, при воздействии меньшей дозы препарата (10 мг/ кг) выявлялась только тенденция к торможению процесса фиброгенеза, а значимое уменьшение площади фиброза было показано при использовании большей дозы препарата. Учитывая приведенные выше особенности окрашивания гистологических срезов пикросириусом красным, наиболее ярко выявляющим сформировавшиеся волокна коллагена, следует отметить, что способ окраски по Массону выявляет более широкий диапазон элементов соединительной ткани при оценке степени нефропатии, т. к. позволяет выявить не только волокнистый компонент, но и аморфное вещество стромы органа. Возможность оценить не только диспозицию волокон коллагена, но также и общую площадь поражения почки при прогрессировании фибротических процессов выбирают многие авторы, используя в качестве оценочного критерия показатель площади интер-стиция, занимающего до 50 % паренхимы почки после операции полной обструкции мочеточника [10]. Однако, при выборе оценочного критерия исключительно на депозиции коллагена в интер-стиции, можно с одинаковым успехом использовать оба метода. Ограничиваясь при трихромном способе окрашивания цифровым анализом яркосинего цветового диапазона, контрастирующего сформированные коллагеновые волокна аналогично ярко-красному диапазону при окраске пи-кросириусом красным. При этом нами было отмечено, что расширение анализируемого цветового диапазона в препаратах, окрашенных пикро-сириусом красным, приводит к артефактному контрастированию сосудов и эпителия, а при окраске препаратов по Массону в зону «захвата» попадает и основное вещество соединительной ткани. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что при оценке фармакологической активности потенциальных противо-фиброзных средств морфологическими методами с использованием системы анализа изображений ВидеоТест Морфология 5.2 оба метода окрашивания позволяют дать количественную оценку формирования интерстициального коллагена. Однако, трихромный метод Массона имеет определенное преимущество, обусловленное более широким диапазоном контрастирования структурных компонентов соединительной ткани по сравнению с монохромным способом окрашивания. Анализ терапевтического эффекта блокатора АТ-1 на модели обструктивной нефропатии по- казал, что лозартан при ежедневном внутрижелу-дочном курсовом введении в течение 9 дней в дозе 30 мг/кг оказывает значимый терапевтический эффект независимо от гистологического метода выявления фиброза.