Особенности накопления флавоноидов в сырье кипрея узколистного (Epilobium angustifolium L.) в зависимости от происхождения и морфологической группы сырья

Кипрей узколистный (Epilobium angustifolium L.) является популярным лекарственным и пище- вым растением, производство которого ежегодно увеличивается.В то же время его можно рассматривать как перспективное лекарственное растение.В 70-х годах получены результаты по применению кипрея узколистного при онкологических заболеваниях. Современные исследования подтверждают его цитостатическую активность на фоне низкой токсичности. Высокая биологическая активность настоя E. angustifolium (кипрея) in vitro подтверждена в модельной системе тканей эпителия кишечника и рака толстой кишки, что делает его потенциально перспективным средством при этом виде онкологии [1]. Настой кипрея не влиял на полезную микрофлору кишечника,но значительно ингибировал кишечную палочку [2]. При наружном и внутреннем применении подавлял рост и развитие Candida albicans [3]. В последние годы на его основе разрабатываются новые ингредиенты для косметики [4]. Этанольный экстракт надземной части E. angustifolium показал высокую ранозаживляющую активность,и как основное действующее вещество рассматривается гиперозид. Благодаря этому экстракт иван-чая может быть применён в качестве ранозаживляющего средства, в частности при пролежнях [5]. В последние годы интерес к нему, и, соответственно, объёмы разнообразие продуктов его переработки существенно возросли [6].

Вместе с тем, кипрей узколистный имеет обширный ареал произрастания и способен расти в широком диапазоне почвенных и погодно-климатических условий [7,8], но при этом наблюдается сильная вариабельность сырья по химическому составу,что приводит к морфологическому (в меньшей степени) и химическому полиморфизму.

Несмотря на то, что в результате фитохимических исследований кипрея в его сырье установлено содержание более 250 различных метаболитов [9], основными фармакологически значимыми соединениями принято считать полифенолы, представленные флавоноидами,фенольными кислотами и элла-готанинами [10-12]. Вместе с тем, в литературе указан очень широкий диапазон содержания этих соединений, причиной которого могут быть как генетические особенности, так и реакция на почвенноклиматические факторы [13]. В частности, обнаружено повышение концентрации флавонол-3-О-глико-зидов с увеличением высоты над уровнем моря с 4,4 мг/г на высоте 800 м до 6,6 мг/г на высоте 1500 м. Кверцетин-3-О-глюкуронид можно рассматривать как потенциальный маркер высотозависимого биосинтеза флавонолов в листе E. аngustifolium [14].

Таким образом, актуальным остаётся вопрос изучения диапазона изменчивости содержания фенольных соединений,в том числе флавоноидов и условий,влияющих на этот параметр.

В соответствии с данной потребностью в представленной работе поставлена цель выявить возможную взаимосвязь между происхождением образца и количественным содержанием флавоноидов в сырье кипрея узколистного, а также их содержанием в зависимости морфологической группы сырья.

Методы

Полевые исследования проводили в 2020 году. Отбор образцов кипрея узколистного проводился в 9 точках трёх регионов центра Европейской части России, а именно в Московской, Ярославской и Калужской областях.

Данные регионы были выбраны по следующим причинам: наличие благоприятных для кипрея условий произрастания; транспортная доступность,поз-воляющая проводить эколого-ресурсные исследования на местности в максимально близкие даты; бόльшая широтная протяжённость охвата исследования в сравнении с долготной, обеспечивающая

Рис. 1. Расположение исследуемых районов на спутниковом снимке. Источник: Google Earth Fig. 1. Location ofthe study areas on a satellite image. Source: Google Earth

увеличение охвата природных подзон. В каждом из регионов были выбраны районы, территория которых и стала объектом применения картографического метода (рис. 1).

В Московской области были выбраны Солнечногорский, Дмитровский, Одинцовский и Шатурский районы, а также городской округ Балашиха, окрестности города Зеленоград и район Северное Бутово города Москвы (Ботанический сад ВИЛАР). Выбранные районы отличаются между собой природно-антропогенными условиями. Солнечногорский район характеризуется рельефом центральной части Клинско-Дмитровской гряды с развитой овражно-балочной сетью на глинистых моренных отложениях, существенным антропогенным освоением. Дмитровский район и город Зеленоград отличаются от Солнечногорского района расположением на северном и южном склонах Клинско-Дмитровской гряды соответственно. Однако окрестности Зеленограда более антропогенно трансформированы, чем территория Дмитровского района. Одинцовский район богат сосновыми лесами на песчаных почвах долины Москвы-реки. При этом он существенно антропогенно трансформирован, преимущественно селитебными территориями. Шатурский район отличается плоским рельефом зандровой равнины на песчаных отложениях, подвергнутый значительной антропогенной нагрузке в прошлом, однако сейчас большая часть территорий используется слабо.В городском округе Балашиха и в районе Северное Бутово естественные местообитания растительности представ- лены фрагментарно. При этом данные территории существенно отличаются по типу ландшафта и по характеру и степени антропогенной нагрузки. Северное Бутово расположено на глинистых почвах Теплостанской возвышенности, известной крутыми склонами и богатой овражно-балочной сетью. Район не испытывает прямого воздействия крупных промышленных объектов, однако расположен вблизи крупных автодорог. Городской округ Балашиха находится на землях плоской песчаной Мещёрской низменности. Данная территория испытывает длительное сильное неблагоприятное воздействие от промышленных объектов и автодорог Московской области и Москвы. В Ярославской области был выбран Переславский район, так как его территория охватывает три из шести преобладающих типов ландшафта Ярославской области, и в нём присутствуют такие контрастные ландшафтные образования как водораздельная гряда бассейнов реки Волга, озера Плещеево и озера Неро (Тархов холм) и древнеледниковая озёрная котловина Плещеева озера. В Калужской области был выбран Боровский район, так как его ландшафтная структура изучена наиболее детально в регионе, а также по причине существенной антропогенной трансформации территории и наличия большого количества нарушенных земель.

Почвенные условия, а также условия растительных сообществ в местах проведения наблюдений и эксперимента определены согласно общепринятой методике [15] и указаны в таблице 1.

Сырьё собирали в фазу массового цветения,раз-

Таблица 1. Характеристика мест обитания изучаемых популяций Table 1. Characteristics of the studied populations habitats

Место сбора	Географическая координата	Почва	Растительное сообщество
Район Северное Бутово города Москвы (Ботанический сад ВИЛАР)	55°33'49.7"N 37°35'16.8"E	Дерново-среднеподзолистая, тяжелосуглинистая, заплывающая.	Кипрейное сообщество
Одинцовский район Московской области (село Ромашково)	55°44'32.4"N 37°18'18.4"E	Дерново-среднеподзолистая, супесчаная с хвойным опадом	Кустарниково-разнотравное сообщество с преобладанием малины и кипрея
Окрестности города Зеленоград (Москва)	55°57'33.0"N 37°09'16.4"E	Дерново-среднеподзолистая, легкосуглинистая	Разнотравное сообщество с преобладанием злаковых и кипрея
Городской округ Балашиха, Московская область	55°47'09.6"N 37°56'24.0"E	Дерново-среднеподзолистая, среднесуглинистая	Разнотравно-кустарниковое сообщество с преобладанием бобовых и кипрея
Дмитровский район Московской области (посёлок Рыбное)	56°23'15.9"N 37°37'16.2"E	Дерново-среднеподзолистая, тяжелосуглинистая	Разнотравное сообщество с преобладанием крапивы, сныти и кипрея
Шатурский район Московской области (посёлок Кривандино)	55°28'24.2"N 39°46'02.0"E	Болотно-подзолистая, песчаная	Кипрейно-цминовое сообщество
Боровский район Калужской области (посёлок Ворсино)	55°13'42.0"N 36°37'30.2"E	Дерново-сильноподзолистая, тяжелосуглинистая	Разнотравное сообщество с равным содержанием злаковых, бобовых и кипрея
Переславский район Ярославской области (деревня Малое Ильинское)	57°02'56.2"N 38°28'32.3"E	Дерново-подзолистая, среднесуглинистая	Кипрейно-крапивно-злаковое сообщество с преобладанием кипрея.
Переславский район Ярославской области (деревня Малое Ильинское)	57°03'05.0"N 38°28'41.9"E	Почва среднесуглинистая, дерново-подзолистая	Кипрейно-крапивно-злаковое сообщество с преобладанием кипрея.

Район Северное Бутово г.Москва (Ботанический сад ВИЛАР)

Боровский район

Калужской области

Солнечногорский район Московской области, вблизи реки Горетовка рядом с городом Зеленоград

деляли на морфологические группы и сушили воздушно-теневым методом.

Для контроля содержания биологически активных веществ существует методика определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин методом спектрофотометрии, основанная на способности образовывать окрашенный комплекс с раствором алюминия хлорида, который вызывает батохромный сдвиг в сторону интенсивных длин волн. Определение проводили на спектрофотометре Cary 100 Scan Varian.

Аналитическую пробу сырья (точная навеска) 0,5 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 0,5мм, помещают в плоскодонную колбу вместимостью 200мл со шлифом и приливают 50мл спирта этилового 50% . Колбу нагревают на водяной бане с обратным холодильником в течение 60 минут с момента закипания. После колбу охлаждают до комнатной температуры. Полученное извлечение фильтруют в мерную колбу на 100 мл. Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях. Объём объединенного фильтрата доводят до метки тем же раствором и перемешивают (Раствор А).

Для приготовления раствора Б в мерную колбу на 25мл приливают 2 мл раствора А, добавляют 2 мл AlCl3 5% в 50% спирте и доводят до метки 50% этиловым спиртом.

Для приготовления раствора сравнения в мерную колбу на 25 мл приливают 2 мл раствора А и доводят до метки 50% этиловым спиртом.

Через 30 минут определяют величину поглощения исследуемого раствора при 409 нм.

Процентное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин рассчитывают по формуле:

A - 1 00 * 25 * 100

X% = ————————— m - 2A1I°% - (100 -W)

где À – оптическая плотность раствора Б m – масса навески сырья, измеренная до 4 знака, г

W – влажность сырья (потеря в массе при высушивании сырья), %

– удельный показатель поглощения комплекса СО рутина с AlCl3 при 409±2нм, равный 249.

Определение внутрилабораторной воспроизводимости методики проводили 2 аналитика на 9 повторностях образца кипрея узколистного листьев каждый, приготовленных независимо друг от друга.Коэффициент вариации не превышает 2 % различия между результатами сотрудников статистически незначимы (Fфакт. (1.07) < Fтабл. (3,44)), что позволяет считать внутрилабораторную воспроизводимость результатов приемлемой.На основании этого были рассчитаны доверительные интервалы для полученных значений.

Результаты и обсуждение

Флавоноидный состав кипрея узколистного довольно разнообразен, в частности обнаружены

Таблица 2. Содержание суммы флавоноидов в сырье кипрея узколистного в зависимости от места сбора Table 2.Accomulation of flavonoids in the raw materials of Epilobium angustifolium L., depending on the place of collection

Место сбора Лист, % Соцветия, % Северное Бутово (Ботанический сад ВИЛАР) 3,38±0,07 3,64±0,07 Одинцовский район Московской области (село Ромашково) 3,00±0,06 3,43±0,07 Окрестности города Зеленоград (Москва) 2,99±0,06 3,72±0,07 Городской округ Балашиха, Московская область 2,44±0,05 4,19±0,08 Дмитровский район Московской области (посёлок Рыбное) 3,20±0,06 4,41±0,09 Московской области (посёлок Кривандино) 4,45±0,09 5,93±0,11 Боровский район Калужской области (посёлок Ворсино) 2,40±0,05 4,27±0,09 Переславский район Ярославской области (деревня Малое Ильинское) 3,09±0,06 3,75±0,07 агликоны флавонолов (кверцетин, кемпферол и мирицетин) и флавоноидные гликозиды,такие как афзелин (кемпферол-3-О-рамнозид), юглалин (кемпферол-3-

О-арабинофуранозид), авикулярин (кверцетин-3-О-α арабинофуранозид), гиперозид (кверцетин-3-О-галактозид), изокверцетин (кверцетин-3-О-глюко-зид), кверцитрин

(кверцетин-3-О-рамнозид) и микелианин (кверце-тин-3-О-глюкуронид). Микелианин является основным флавоноидом E. angustifolium , тогда как мири-цитрин (мирицетин-3-О-рамнозид) является основным флавоноидом у других видов [14]. Некоторые из этих соединений фармакологически активны и имеют значение для нейропротекторного,противо-воспалительного, антиоксидантного, антипролифе-ративного и др действия сырья кипрея.

В результате исследований выявлены существенные колебания в содержании флавоноидов в зависимости от места произрастания. Определять

Рис. 2. Зависимость между содержанием флавоноидов в листьях и соцветиях в сырье кипрея узколистного Fig. 2. The relationshipbetween flavonoids accumulation in leaves and in inflorescences ofEpilobium angustifolium L.

содержание флавоноидов в надземной массе в целом мы сочли нецелесообразным, так как по данным Jurgenson с соавт. (2012) [16] содержание флавоноидов в стеблях не превышало 0,06% . Содержание флавоноидов в листьях и соцветиях представлено в таблице 2.

Из данных, представленных в таблице 2, следует что содержание флавоноидов существенно отличалось в зависимости от места произрастания и находится в пределах от 2,40 до 4,45% –в листьях и от 3,43 до 5,93% – в соцветиях кипрея. Наибольшее содержание действующих веществ выявлено в образцах, собранных в популяции из Кривандино (Шатурский район, Московская область), в которой распространены болотно-подзолистые песчаные почвы с кипрейно-цминовым растительным сообществом. Оценивая полученные данные в сравнении с другими авторами [16], можно отметить, что наши результаты несколько выше. В условиях Эстонии накапливалось 1,63-2,19% флавоноидов.

При сопоставлении содержания флавоноидов в листьях и соцветиях,в последних отмечено их более высокое содержание. Вероятно, это можно объяснить дополнительным высоким накоплением антоцианов.

Корреляционный анализ, направленный на выявление возможной связи между содержанием флавоноидов в листе и соцветиях выявил среднюю положительную корреляцию равную 0,65 (рис. 2).

Попытка выявить положительную корреляцию между географической широтой расположения популяции и содержанием флавоноидов дала отрицательный результат. Значения составили R=-0,223 – для соцветий и R=-0,0132 – для листьев кипрея.

Таким образом, кипрей узколистный характеризуется достаточно высоким содержанием флаво-ноидов,но при этом оно колеблется в зависимости от морфологической группы сырья (листья-цветки) и места произрастания. Также следует отметить, что если содержание высокое в листьях, то с большой долей вероятности (0,65 при Р≤ 0,05) оно будет высоким и в соцветиях.

Заключение

Об авторах:

Михаил Сергеевич Антоненко – м.н.с. отдела

Растительных ресурсов ФГБНУ ВИЛАР,

,Author ID: 1106639, автор для переписки,

Евгения Юрьевна Зуйкова – ассистент Кафедры овощеводства

Института садоводства и ландшафтной архитектуры РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Aboutthe Authors:

MikhailS.Antonenko – Researcher, , Correspondence Author, Evgeniya Yu.Zuikova – assistant ofthe Department ofVegetable Growing,

Institute of Horticulture and Landscape Architecture

Vyacheslav N.Dul– Cand. Sci.(Farm.), Leading Researcher,Center for Chemistry ofNatural Compounds, VILAR, IRID: 49772913 Elena L.Malankina – (Agriculture), Prof., , AuthorID: 375217,