Особенности неадаптивного остеогенеза субхондральной кости при артериальной гипертонии и дислипидемии

Артериальная гипертония (АГ) и гиперлипидемия – ключевые кардиометаболические факторы развития сердечно-сосудистых заболеваний. В настоящее время достигнуто достаточно глубокое понимание молекулярно-клеточных механизмов формирования ремоделирования сердечно-сосудистой системы в результате воздействия АГ и гиперлипидемии [1]. Уточнены сосудистые паттерны почечной дисфункции, поражения головного мозга [2]. Известно, что АГ, реализуясь повсеместно оказывает негативное влияние на все органы и ткани путём формирования типовых патогенетических каскадов, результатом которых является ремоделирование тканей с преимущественным замещением их соединительной тканью [1]. Дислипидемия, реализующаяся в рамках воспалительной реакции за счёт активации системы врождённого иммунитета, так же способствует полиорганному поражению. Этот феномен реализуется через импрегнацию липидов в тканях, развитие локальной и системной воспалительной реакции [3].

В последние годы все больше данных свидетельствуют о способности кардиоваскулярных факторов оказывать непосредственное влияние на ткани суставов, приводя к их ишемии, микротромбозам и реактивным изменениям костной ткани [4]. Так, Tsezou A.С. соавт. (2010) показали, что липиды способны депонироваться в суставном хряще [5]. Другие данные свидетельствуют о прямом влиянии гипрлипидемии на ремоделирование субхондральной кости (СХК), приводя к развитию дегенеративно-воспалительного заболевания – остеоартрита [6]. Примечательно, что широко распространённое заболевание – остеоартрит высоко ассоциировано с артериальной гипертонией и гиперлипидемией [5]. Вместе с тем, молекулярно-клеточные механизмы влияния артериальной гипертонии и дислипидемии на ткани суставов и их роль в развитии остеоартрита изучена недостаточно.

Субхондральная кость, как известно, обеспечивает амортизационную, локомоторную и трофическую функции сустава, что подчёркивает важность её в развитии заболеваний суставов. Ремоделирование СХК представляет собой процесс неадаптивной остеорегенерации, приводящий к существенным биохимическим, биомеханическим, морфологических сдвигам, нарушающих нормальную функцию суставов [7]. Наибольшее значение неадаптивный остеогенез имеет в развитии остеоартрита [8]. Можно предположить, что кардиометаболические факторы, реализующиеся через сосудистые паттерны, способны приводить к ремоделированию СХК, снижать её трофический потенциал по отношению к бессосудистому суставному хрящу. Очевидно, что изучение влияния факторов кардиоваскулярной коморбид-ности будет способствовать лучшему пониманию патогенеза остеоартрита, раскрытию интегративной теории патогенеза, совершенствованию способов профилактики и лечения.

Цель исследования

Изучить влияние артериальной гипертонии и гиперлипидемии на процессы клеточного стресса, ремоделирование СХК.

Материалы и методы

Экспериментальное воспроизведение артериальной гипертонии, гиперлипидемии и их сочетания проводили на 24 половоз- релых беспородных морских свинках мужского пола в возрасте 28-30 недель, весом 650-800 г в соответствии с положениями Хельсинкской декларации и рекомендациями Директивы Европейского сообщества (86/609 Г.С), дизайн исследования одобрен междисциплинарным этическим комитетом ФГБОУ ВО ТГМУ Минздрава России (протокол № 6 от 18.10.2014).

Животных разделили на 4 группы по 6 в каждой. В первой группе моделировали АГ с помощью внутримышечных инъекций раствора гидрокартизона в дозе 0,5 мг на 500 г массы животного кратностью 4 раза в неделю в сочетании с заменой питьевой воды на 0,9% раствор хлорида натрия. Во второй группе моделировали гиперлипидемию путём внутрибрюшинных инъекций 1,2 мл Твин-80 1 раз в 3 недели и модификацией рациона, который содержал 50% животных жиров, 40% сахаров и 10% клетчатки. В третьей группе животных комбинировали условия эксперимента 1 и 2 групп, добиваясь тем самым сочетания АГ и гиперлипидемии. Четвёртая группа (контроль) получала сбалансированный рацион. На протяжении эксперимента всем животным проводили еженедельные измерения систолического артериального давления, пульса в области плеча с использованием ML125/R (ADInstruments, Австрия). На 60 сутки животные были выведены из эксперимента передозировкой ксилозила и прометара, после чего производили забор образов крови для определения уровня общего холестерина на биохимическом анализаторе IDEXX (VetTest, США). Общая характеристика экспериментальных животных представлена в таблице 1.

Таблица 1

Характеристика животных в конце эксперимента (Ме [Q25; Q75])

Параметр, единицы измерения	Экспериментальные группы животных			Контроль (n=6)
	Артериальная гипертония (n=6)	Гиперлипидемия (n=6)	Артериальная гипертония и гиперлипидемия (n=6)
Возраст, недели	39 [37; 40]	39 [38; 41]	38 [37; 40]	38 [37; 39]
Вес, г	660 [640; 840]	850 [750; 960]	880 [750; 910]	750 [630; 840]
Систолической артериальное давление, мм рт. ст.	190 [165; 220]	135 [132; 140]	205 [172; 225]	130 [125; 135]
Пульс, ударов в минуту	380 [325; 390]	320 [304; 325]	374 [331; 380]	309 [285; 315]
Общий холестерин, ммоль/л.	2,55 [1,91; 2,80]	12,17 [10,34; 14,71]	11,66 [10,40; 15,55]	2,09 [1,76; 2,20]

Ткани коленных суставов задних лап фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (24 ч), декальцинировали в электролитном растворе (Biovitrum, Россия). По стандартному методу проводили заключение в парафин и получали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилин эозином. Препараты оценивали с помощью микроскопа CX41

(Olympus, Япония), оснащенного цифровой камерой. Морфометрическую обработку полученных изображений осуществляли с помощью программы ImageJ 4.1. В качестве показателей при морфометрии субхондральной кости исследовали толщину собственной пластинки, толщину трабекулы, ширину межтрабекулярных пространств, костный индекс (отношение толщины трабекулы к ширине межтрабекулярного пространства - ТР/МП в процентах), количество остеоцитов в мм2 и остеобластов в мм2.

Статистический анализ результатов проводили с помощью Statistica 6.0 (StatSoft, США). Нормальность распределения показателей оценивали по значению медианы (Ме) и квартилей [Q25; Q75]. Поскольку в изучаемых выборках распределение значений не соответствовало по Колмогорову нормальному, для оценки достоверности различий при сравнении двух групп переменных использовали U-критерий Манна–Уитни и трёх – непараметрический H-критерий Краскела-Уоллиса. Достоверными считали различия показателей при p<0.05.

Результаты

У животных из контрольной группы собственная пластинка СХК (рис. 1, фрагмент А) была выполнена компактным веществом с направлением волокон по фронту костного образования и однородной минерализацией. Остеоциты имели продолговатые ядра и располагались вдоль волокон и пластин остеонов. Обнаруживали остеоны с гаверсовыми каналами и узкими вставочными сосудами, окруженные тремя-четырьмя слоями пластин. Губчатая кость (рис. 2, фрагмент А) у контрольных животных была представлена стереотипным чередованием костных трабекул и лакун. Трабекулы губчатой кости были выполнены костным веществом с направлением волокон по ходу цементных линий и остеоцитами разной степени дифференцировки. Эндост содержал обилие остеобластов и единичные остеокласты.

Рисунок 1. Морфология компактной пластинки субхондральной кости у экспериментальных животных. А – контрольная группа, Б – артериальная гипертония, В – гиперлипидемия, Г, Д – сочетание артериальной гипертонии и гиперлипидемии. Пояснения в тексте. (окраска гематоксилин и эозин, ув. х 200, масштаб 200 мкм).

При АГ собственная пластинка СХК (рис. 1, фрагмент Б) была представлена компактным веществом с разнонаправленным расположением соединительнотканных волокон с разной степенью обызвествления. Остеоциты имели крупные ядра. Встречались в большом количестве пустые костные лакуны, скопления остеокластов. Обнаруживали крупные каналы резорбции с депонированными остеобластами, но без признаков формиро- вания вторичных остеонов. Множество кровеносных сосудов лежали как в составе гаверсовых систем, так и обособленно в межклеточном веществе. Встречались единичные остеоны. При АГ в губчатой кости (рис. 2, фрагмент Б) обнаруживали разнонаправленные явления в виде сочетания новообразованных пакетов трабекулярной кости с чёткими очерченными реверсными (цементными) линиями и признаками резорбции со стороны эндоста с остеокластами и типичными лакунами Хоушипа.

Рисунок 2. Морфология губчатой части субхондральной кости у экспериментальных животных. А – контрольная группа, Б – артериальная гипертония, В – гиперлипидемия, Г, Д – сочетание артериальной гипертонии и гиперлипидемии. Пояснения в тексте. (окраска гематоксилин и эозин, ув. х 200, масштаб 200 мкм).

Как показали результаты морфометрии (табл. 2), в условиях экспериментальной АГ толщина собственной пластинки СХК была статистически значимо меньше по сравнению с группой контроля (z=-2,1, p=0,04), но не отличалась от группы экспериментального сочетания АГ и гиперлипидемии (z=1,4, p=0,1). Толщина костных трабекул при АГ достоверно не отличалась от контроля (z=1,9, p=0,05), но была значимо больше по сравнению с группой сочетания АГ и гиперлипидемии (z=2,1, p=0,04). Ширина межтрабкулярных пространств была статистически значимо меньше при АГ по сравнению с контролем (z=-2,1, p=0,04) и не отличалась от группы сочетания кардиометаболических факторов (z=-1,9, p=0,05). При этом костный индекс был достоверно выше у животных с АГ относительно контроля и животных с сочетанием АГ и гиперлипидемии (соответственно: z=2,7, p=0,006; z=2,7, p=0,006). Количество остеоцитов было значимо меньше при АГ по сравнению с группами контроля и сочетанного моделирования АГ и гиперлипидемии (соответственно: z=-2,9, p=0,004; z=-2,9, p=0,004). Численность остеобластов также была статистически значимо ниже по сравнению с контролем (z=-2,9, p=0,004), но не различалось по сравнению с группой АГ и дислипидемии (z=1,9, p=0,05).

При гиперлипидемии в собственной пластике СХК (рис. 1, фрагмент В) наблюдалась картина эндохондрального остеогенеза с инвазией в базальную зону суставного хряща. Сформированные фронты оссификации образовывали остеоны с широкими гаверсовыми каналами и вставочными кровеносными сосудами. Обнаруживались каналы резорбции различного калибра с остеокластами и остеобластами, окруженные концентрическими пластинками. Встречались единичные остеоны. В трабекулах губчатой кости при гиперлипидемии (рис. 2, фраг- мент В) обнаруживали тонкие новообразованные пакеты кости с нечётко очерченными реверсными (цементными) линиями. Структура трабекул была представлена остеонами, чередующимися с участками слабо кальцинированного матрикса.

Таблица 2

Результаты морфометрии субхондральной кости в исследуемых группах (Ме [Q25; Q75])

Параметр, единицы измерения	Артериальная гипертония	Гипер-ли-пидемия	Артериальная гипертония и гипер-ли-пидемия	Контроль	H- критерий
Толщина собственной пластинки, мкм	530,3 [480,2; 570,9] *	830,9 [760,9; 885,1] ǂ	450,4 [431,5; 462,4] *	837,1 [602,5; 923,2]	15,5, p=0,001
Толщина трабекулы, мкм	368,9 [328,8; 391,8] ǂ	481,8 [452,7; 507,2] * ǂ	260,2 [241,3; 298,3]	300,9 [291,0; 334,0]	16,82, p=0,0008
Ширина межтра-бекуляр-ных пространств, мкм	718,6 [548,9; 750,3] *	860,9 [781,4; 952,7]	861,3 [850,2; 920,6]	800,6 [770,2; 822,0]	6,5, p=0,09
Костный индекс (отношение ТР/ МП), %	54,1 [41,9; 67,0] * ǂ	56,8 [52,5; 63,5] * ǂ	31,4 [28,5; 34,9]	37,2 [35,4; 38,7]	16,7, p=0,0008
Количе ство осте-оцитов в мм2	63,2 [56,0; 58,0] * ǂ	81,0 [80,0; 84,0] *	80,0 [76,0; 80,0] *	106,0 [98,0; 110,0]	19,9, p=0,0002
Количество остеобластов в мм2	24,0 [21,0; 26,0] *	39,0 [37,0; 40,0] ǂ	20,0 [18,0; 22,0] *	38,6 [36,0; 45,0]	18,4, p=0,0004

* – различия статистически значимы по сравнению с контролем, p<0,05; ǂ – различия статистически значимы по сравнению с сочетанием артериальной гипертонии и дислипидемии, p<0,05

В условиях экспериментального моделирования гиперлипидемии толщина компактной части СХК достоверно не отличалась от группы контроля (z=0,3, p=0,7), но была значимо выше по сравнению с животными из группы экспериментального моделирования сочетания АГ и гиперлипидемии (z=2,9, p=0,004). При этом толщина костных трабекул была статистически значимо выше по сравнению с группой контроля и сочетания кардио-метаболических факторов (соответственно: z=2,9, p=0,004; z=2,9, p=0,004). Костный индекс был значимо выше при гиперлипидемии относительно контроля и животных с сочетанием АГ и гиперлипидемии (соответственно: z=2,7, p=0,006; z=2,9, p=0,004). Число остеоцитов у животных с экспериментальной гиперлипидемией было достоверно ниже относительно контроля (z=-2,9, p=0,004), но значимо не различалось в сравнении с группой животных, у которых моделировали сочетание гипертонии и гипер- липидемии (z=1,1, p=0,3). При этом количество остеобластов статистически значимо не отличалось от группы контроля (z=-0,4, p=0,7), но было выше по сравнению с группой сочетания АГ и гиперлипидемии (z=2,9, p=0,004).

При сочетании АГ и гиперлипидемии (рис. 1, фрагменты Г и Д) компактное вещество пластинки субхондральной кости было представлено разнонаправленными фибриллярными элементами межклеточного матрикса. Встречались гипертрофированные остеоциты и пустые костные лакуны. На границе с суставным хрящом обнаруживали множественные очаги деструкции костной ткани в виде полостей регенерации с депонированием остеокластов и остеобластов с тонкими концентрическими пластинками. Преимущественное на границе с хрящом встречались единичные остеоны с крупнокалиберными вставочными сосудами. В глубоких слоях собственной пластинки наблюдалась картина ремоделирования кости по типу замещения остеоподобны-ми грубоволокнистым матриксом с оссификацией в сочетании с множеством кистозных полостей и элементов несовершенного остеогенеза. При сочетании АГ и гиперлипидемии обнаруживали микропереломы трабекул губчатой кости (рис. 2, фрагмент Г) на фоне активации эндостального остеокластогенеза. В трабекулах обнаруживались грубоволокнистые разнонаправленные тяжи с разной степенью минерализации. В межтрабекулярных пространствах определились множественные элементы микро-сосудистого русла.

В условиях сочетанного влияния АГ и дислипидемии отмечалось статистически значимое снижение морфометрических показателей толщины компактной пластинки СХК, костного индекса, количества остеоцитов и остеобластов (соответственно: z=-2,7, p=0,006; z=-2,7, p=0,004; z=-2,9, p=0,004; z=-2,9, p=0,004) относительно группы контроля. При этом толщина трабекул и ширина межтрабекулярных пространств статистически значимо не отличались относительного контрольной группы (соответственно: z=-1,6, p=0,1; z=1,4, p=0,1).

Обсуждение

Результаты исследования показали, что кардиоваскулярные факторы индуцируют ремоделирование субхондральной кости. Данный процесс характеризуется изменением структуры компактной и трабекулярной её частей, формируя картину неадаптивного остеогенеза. Общими чертами ремоделирования костной ткани при этом является образование каналов резорбции при дефиците полноценных остеонов, избыточная васкулариза-ция, уменьшение числа остеобластов. Важно отметить, что активация остеокластов сочетается с формированием остеоподобного матрикса и повышением массы кости, основой которого является неравномерно оссифицированная грубоволокнистая матрица. Такая гистохимическая картина СХК наиболее характерна для остеоартрита – гетерогенного заболевания, в основе которого лежит клеточный стресс и неадаптивные процессы тканевого ремоделирования суставного хряща и субхондральной кости [8]. В предыдущих исследованиях было показано, что ОА характеризуется прогрессирующим истончением собственной пластинки, эктопической выскуларизацией СХК и суставного хряща, замещением нормальной кости остеоподобным матриксом [6].

В настоящем исследовании впервые показано влияние кардиоваскулярных факторов – АГ, гиперлипидемии и их сочетаний на процессы ремоделирования СХК. Wen C.Y. и соавторы (2013) изучая остеоартрит, ассоциированный с артериальной гипертонией и сахарным диабетом 2 типа, с помощью микро-КТ показали истончение собственной пластинки СХК [9]. Исследования отечественных авторов показали возрастание костной массы СХК при остеоартрите коленного сустава [10], что в полной мере согласуется с результатами нашего исследования.

Установлено, что кардиоваскулярные факторы неодинаково влияют на процесс ремоделирования СХК. Так, при АГ наблюдается активация ангиогенеза с формированием эктопических элементов микроциркуляторного русла. В то время как в собственной пластинке преобладают процессы резорбции, приводящие к её истончению, в губчатой кости преобладают пролиферативные процессы, приводящие к утолщению костных трабекул, уменьшению межтрабекулярных пространств и увеличению костной массы. Весьма интересно, что такой вариант ремоделирования сопровождается значимым уменьшением числа остеобластов и остеоцитов. Известно, что АГ приводит к эпизодам снижения кровотока, венозной окклюзии с застоем и микроэмболией в субхондральных сосудов [11]. В условиях ишемии СХК под влиянием эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF) формируется патологический ангиогенез [12]. VEGF-ин-дуцированный ангиогенез, с одной стороны приводит к склерозу собственной пластинки СХК через активацию системы матрикс-ных металлопротеиназ [13], с другой активирует апоптоз остео-цитов [14]. Таким образом есть основания полагать, что АГ через сосудистую ишемиюмзапускает молекулярно-клеточные механизмы, приводящие к неадаптивному ремоделированию СХК.

Для гиперлипидемии характерна картина эндохондрального остеогенеза с инвазией в зону кальцинированного хряща. В компактной кости наблюдается картина несовершенного остеогенеза. Трабекулы губчатой кости образуют остеоны и участки некальцинированного матрикса. При этом утолщение трабекул приводит к повышению массы костной ткани без сужения межтрабекулярных промежутков. Известно влияние холестерина на костную ткань, связанное с активацией активных форм кислорода, матриксных металлопротеиназ, митохондриальной дисфункцией остеоцитов и остеобластов [3]. Оксидативный стресс способен индуцировать гипертофическую дифференцировку хондроцитов базальной зоны хряща, что определяет появление эндохондральной кальцификации [15]. В условиях оксидативного стресса активируются процессы апоптоза [16], что обуславливает признаки несовершенного остеогенеза и снижение количества остеоцитов. При этом количество остеобластов существенно не снижается, что может быть обусловлено резистентностью к неблагоприятному влиянию активных форм кислорода [17], в том числе ввиду их низкой метаболической активности.

Наиболее выраженные изменения претерпевает субхондральная кость в условиях сочетанного влияния артериальной гипертонии и гиперлипидемии. Тонкая компактная пластинка на всём протяжении замещается остеоподобным матриксом с множеством бесклеточных кистозных полостей. Трабекуляр- ная кость характеризуется активацией остеокластов и истончением костных балок. В этих условиях масса кости не изменяется. Влияние на СХК сочетания АГ и гиперлипидемии ранее не изучалось. Однако мы предполагаем, что АГ вызывает ишемию СХК, венозные полнокровие, что приводит к волочению внутрикостного давления [11]. Вазоактивные вещества, такие как оксид азота, эндотелин, ангиотензин II, повышают проницаемость сосудистой стенки, способствуют хематаксису клеток врождённого иммунитета [18], апоптозу метаболически-активных осте-оцитов, сменяющийся активацией остеокластов. Повышенное костное давление, ишемия, протеазы макрофагов, тканевые металлопротеиназы и апоптоз остеоцитов могут способствовать развитию неадаптивной остеорегенерации, ремоделированию СХК в условиях сочетания АГ и гиперлипидемии. Однако молекулярные механизым сочетанного влияния кардиометаболиче-ских факторов еще предстоит изучить.

Заключение

Молекулярные и клеточные механизмы влияния артериальной гипертонии и дислипидемии на субхондральную кость изучены недостаточно, что препятствует пониманию взаимосвязей сердечно-сосудистых заболеваний и развитию дегенеративновоспалительных заболеваний суставов. В настоящем исследовании установлено, что кардиоваскулярные факторы в экспериментальных условиях оказывают влияние на СХК, приводя к изменениям, напоминающим остеоартрит. Результаты исследования показали, что АГ и гиперлипидемия способствуют повреждению и формированию неадаптивной остеорегенерации СХК. Так же установлены частные особенности патологической регенерации и ремоделирования при воздействии артериальной гипертонии, гиперлипидемии и их сочетании.